[發明專利]多交叉擴增結合金納米生物傳感檢測副溶血性弧菌的方法

有效

• 申請號: 201611105333.6
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106755358B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 葉長蕓;王毅;王艷
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;C12Q1/689;C12N15/11
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

1.一種非診斷目的的多交叉恒溫擴增結合金納米生物傳感檢測目的基因的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)提取待檢測樣品的基因組；

(2)提供置換引物F1和F2，提供交叉引物CP1和CP2，同時提供在交叉引物CP1或CP2的5’端標記有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供擴增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，同時提供在所述擴增引物C1或C2的5’端標記半抗原的擴增引物C1*或C2*；所述置換引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置換引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端標記有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示，引物C1的序列如SEQ IDNO:6所示，在所述引物C1的5’端標記有熒光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ IDNO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示，在所述擴增引物C1*或C2*的5’端所標記的半抗原為熒光素，在交叉引物CP1*的5’端標記生物素，在所述擴增引物C1*的5’端標記熒光素；

(4)在鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調節劑、引物存在下，使用待檢測樣品的基因組的核酸作為模板恒溫擴增DNA；

(5)使用金納米生物傳感器檢測步驟(4)的擴增產物。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述金納米生物傳感器包括一背板，在所述背板上依次設置裝有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜及吸水墊，在所述硝酸纖維素膜上依次設置檢測線及控制線，在金標墊、檢測線及控制線區域依次包被有金納米粒子偶聯的鏈霉素親和素、抗熒光素抗體及生物素偶聯的牛血清蛋白。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增是在61-64℃的環境中進行的。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增是在62℃的環境中進行的。

5.一組用于恒溫擴增副溶血性弧菌的toxR基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置換引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置換引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的擴增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的擴增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的擴增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的擴增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的擴增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的擴增引物R2，同時提供在交叉引物CP1或CP2的5’端標記有生物素的交叉引物CP1*或CP2*，以及在所述擴增引物C1或C2的5’端標記半抗原的擴增引物C1*或C2*。

6.根據權利要求5所述的引物序列，其特征在于，在交叉引物CP1*的5’端標記生物素，在擴增引物C1*的5’端標記有熒光素。