[發明專利]一種分析處理農作物熒光毛細管電泳圖譜的方法

有效

• 申請號: 201611102078.X
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106591443B
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 張憲晨;朱麗;劉越;閆珍臣
• 申請（專利權）人: 北京華生恒業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G06F19/26
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙)11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發明一般地涉及生物遺傳學和基因組學領域，并且更特別地，涉及一種分析處理農作物熒光毛細管電泳圖譜的方法及其裝置。

背景技術

熒光毛細管電泳是處理分析生物遺傳物質常用的方法。不同長短的遺傳片段可以通過電泳分離，而來源不同但相同長短的遺傳片段則可以通過不同的熒光顏色進行區分。在用熒光標記引物時，PCR擴增產物的有無或多少是通過檢測熒光強度來判定的，但是不同顏色的熒光波譜之間是有重疊的。如果某一種顏色的信號過強，超過了程序的處理范圍，或者超出了儀器的檢測能力，就會在一種顏色出現超高峰的位置還出現另一種顏色的小峰，這個小峰即為拔起(pull up)峰。這種由于顏色從一個光譜通道擴散到另一個的“拔起現象”廣泛存在于熒光電泳實驗環境。

相對于人類遺傳資源的研究，農作物遺傳資源的研究相對落后。目前用于農作物基因標記的引物設計相對匱乏，也沒有成熟的試劑盒，這導致經PCR擴增和熒光毛細管電泳產生的農作物基因檢測圖譜存在較多的拔起峰，且這些拔起峰的峰高較高，不容易與其他正常的峰作區分。并且，由于標準物產生的內標色帶峰高較低，如果此時樣品產生的普通色帶與內標色帶有重合的峰，正常的內標標準峰將很有可能被當做拔起峰而被刪除，從而會導致內標校準較差或失效。這樣的情況在農作物拔起峰普遍峰高較高的環境下會更加嚴重。另外，農作物電泳后產生的基因檢測圖譜容易產生連續多峰，即一系列等間距、間距不大于2.5bp且峰數大于2的峰，若拔起峰出現在連續多峰區域，則有可能會被當做連續多峰被而被忽略，造成多讀峰或讀錯峰的情況。

現有處理熒光毛細管電泳圖譜中拔起峰的方法通常只是將相鄰色帶圖譜對比以篩查出拔起峰，并將篩查出的拔起峰簡單刪除。但這種方法無法有效處理農作物檢測圖譜中與內標色帶有重合或處于連續多峰段的拔起峰，往往會使得內標校準較差甚至失效或者造成多讀峰或讀錯峰的情況，從而導致檢測結果出現較大偏差甚至是檢測失敗。因此，如何能在不影響內標校準和丟失峰的情況下將拔起峰做有效處理，從而提高農作物熒光毛細管電泳圖譜基因檢測正確率是本領域技術人員需要解決的一個關鍵技術問題。

發明內容

為了解決現有技術中存在無法有效處理農作物熒光標記檢測圖譜中拔起峰的問題，本發明的目的是提供一種分析處理農作物熒光標記檢測圖譜的方法，包括曲線處理、內標校準以及片段分析和基因分型3個主要處理步驟，其特征在于,曲線處理中還包括拔起峰處理，所述拔起峰處理包括以下步驟：

1)重合峰定位：將A色帶與B色帶做對比，找到B色帶中位置與A色帶峰的位置重合的峰，將這些峰定為重合峰，其中A色與B色熒光光譜有重疊并且A色帶會造成B色帶拔起；

2)重合峰分組：

當步驟1)定位的重合峰的位置與內標標準峰的位置重合時，將這些重合峰定為拔起峰I，

當重合峰位于連續多峰段時，將這些位于連續多峰段的重合峰定為準拔起峰；

當重合峰的位置既不在連續多峰段又不與內標標準峰重合時，將這些重合峰定為拔起峰II，

3)重合峰處理：

記錄各個拔起峰I的位置以供后續內標校準步驟參考并消除拔起峰I，

消除拔起峰II，

記錄準拔起峰的總個數N以及各個準拔起峰的位置X_i^B，其中，i是不小于0且不大于N的整數，

當N為0時，結束拔起峰處理步驟；

4)準拔起峰分組：將位置為X_i^B±32frame的所有B色帶內的峰分為第i組；

5)準拔起峰再分組：將步驟4中的N個組進行再分組，即找到每組中的最高峰，將最高峰及其左右兩峰分為這個組的一個子組1i，組內的其他峰分為另一子組2i；

6)拔起峰III判斷：在步驟5確定的每個ai子組內，

a)將子組位置范圍內A色帶峰的峰高排序并將這個范圍內的最高峰的位置定為X_ai^A，另外將子組內最高峰的位置定為X_ai^B，

b)將X_ai^B與X_ai^B對比，若X_ai^B≠X_ai^B，子組ai中的所有峰都被判斷為不是拔起峰III，反之則進行下一步判斷，