[發明專利]膠質母細胞瘤中同時敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法

有效

• 申請號: 201611101618.2
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106754917B
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 康春生;黃凱;王蘊非;王琦雪;楊超
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學總醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 12103 天津市宗欣專利商標代理有限公司
• 代理人: 孫喬喬

本發明公開了一種膠質母細胞瘤中同時敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法，涉及DNA重組技術。本發明中的sgRNA在EGFR基因的靶向位點位于EGFR基因的第17號外顯子上，是表達EGFR跨膜區的基因序列。本發明通過分別構建Cas9和sgRNA慢病毒，并將二者感染膠質瘤細胞的方法，從而達到同時敲除膠質瘤細胞中EGFRwt/vIII的目的。使用本發明所述方法可同時穩定的敲除EGFR wt和EGFRvIII兩個基因，敲除后可有效的抑制腫瘤發生發展。本發明所述sgRNA有望在治療EGFR擴增和EGFRvIII突變型膠質母細胞瘤的新型藥物中得到應用。

技術領域

本發明涉及DNA重組技術，更具體地是一種膠質母細胞瘤中同時敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法。

背景技術

膠質瘤是人顱內最常見的原發腫瘤，膠質母細胞瘤是其最惡性的一種，盡管使用先進的技術手術治療和放化療，膠質母細胞瘤的平均生存期仍保持在14個月左右，治療膠質母細胞瘤是一個世界難題。患膠質母細胞瘤的患者，40-60%具有EGFR擴增，約25%伴有EGFR的III型突變（EGFRvIII），這兩種情況都使EGFR活性增強，增強腫瘤的惡性程度和降低患者的預后。目前，針對EGFR擴增和突變體治療的EGFR單克隆抗體（mAb）和小分子抑制劑（TKI）在肺癌中取得了成功，但是因為血腦屏障的存在，mAb和TKI不能到達膠質母細胞瘤，并且許多mAb和TKI并不能針對EGFRvIII起作用。

CRISPR/CAS9（Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/Cas9）是一種新興的并日趨成熟的基因編輯技術。使用一段序列特異性向導RNA分子(sgRNA)引導核酸內切酶（Cas9）到靶點處，從而完成基因組的編輯。切開的DNA可以通過非同源末端鏈接（NHEJ）的方式修復DNA損傷，從而形成開放讀碼框的改變，影響基因的轉錄與翻譯。

對于以EGFR擴增和EGFRvIII突變的膠質母細胞瘤來說，阻斷或抑制EGFR wt/vIII的表達是治療該型腫瘤的有效手段，但是如何同時針對EGFR wt/vIII的表達進行阻斷和抑制是擺在眼前的難題。

發明內容

本發明為了解決現有的技術手段無法同時阻斷或抑制EGFRwt和EGFRvIII的表達的問題，所提出一種膠質母細胞瘤中同時敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法。

本發明是按照以下技術方案實現的。

一種在膠質母細胞瘤中基于CRISPR/Cas9系統同時靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA，所述sgRNA的基因序列如Seq ID NO.1所示。

所述sgRNA在EGFR基因的靶向位點位于EGFR基因的第17號外顯子上，是表達EGFR跨膜區的基因序列。

所述sgRNA指導的CRISPR/Cas9系統在治療膠質母細胞瘤的新型藥物中的應用。

一種膠質母細胞瘤中同時敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法：包括以下步驟：

A. Cas9和sgRNA慢病毒設計和包裝：將權利要求1所述sgRNA序列使用GV371質粒連接；將含有表達sgRNA或Cas9的質粒的轉染體系混合物采用瞬時共轉染法轉入 293T 高表達細胞系而產生重組慢病毒；最后重組慢病毒分泌到培養基中進行培養而得到大量載體慢病毒；

B.CRISPR/Cas9靶向EGFRwt/vIII抑制膠質瘤細胞：將合成好的Cas9病毒以感染復數為1加入U87膠質瘤細胞，用含10%FBS的DMEM培養，嘌呤霉素篩選5-7天后，加入EGFRsgRNA病毒，5-7天后收集細胞，western blot檢測EGFR及下游基因表達，提取DNA進行EGFR基因測序，并行CCK8細胞增殖試驗。

本發明獲得了如下有益效果。