[發明專利]膠質母細胞瘤中同時敲除EGFRwt和EGFRvIII的方法

有效

• 申請號: 201611101618.2
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106754917B
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 康春生;黃凱;王蘊非;王琦雪;楊超
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學總醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 12103 天津市宗欣專利商標代理有限公司
• 代理人: 孫喬喬

1.一種在膠質母細胞瘤中基于CRISPR/Cas9系統同時靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA的基因序列如Seq ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的一種在膠質母細胞瘤中基于CRISPR/Cas9系統同時靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA在EGFR基因的靶向位點位于EGFR基因的第17號外顯子上，是表達EGFR跨膜區的基因序列。

3.根據權利要求1所述的一種在膠質母細胞瘤中基于CRISPR/Cas9系統同時靶向敲除EGFRwt和EGFRvIII的sgRNA在制備治療膠質母細胞瘤的藥物中的應用。

4.一種同時敲除EGFRwt和EGFRvIII的膠質母細胞瘤的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

A.Cas9和sgRNA慢病毒設計和包裝：將權利要求1所述sgRNA序列使用GV371質粒連接；將含有表達sgRNA或Cas9的質粒的轉染體系混合物采用瞬時共轉染法轉入293T高表達細胞系而產生重組慢病毒；最后重組慢病毒分泌到培養基中進行培養而得到大量載體慢病毒；

B.CRISPR/Cas9靶向EGFRwt/vIII抑制膠質瘤細胞：將合成好的Cas9病毒以感染復數為1加入U87膠質瘤細胞，用含10％FBS的DMEM培養，嘌呤霉素篩選5-7天后，加入EGFR sgRNA病毒，5-7天后收集細胞，western blot檢測EGFR及下游基因表達，提取DNA進行EGFR基因測序，并行CCK8細胞增殖試驗。