[發明專利]促進CIK細胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培養基、培養方法和應用

有效

• 申請號: 201611094616.5
• 申請日: 2016-12-02
• 公開（公告）號: CN106591231B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 謝昕;陳春;胡華軍;楊連陽
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C08B37/00
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明涉及一種能促進CIK細胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、及其培養基、培養方法和應用。所述卡介菌多糖核酸提取液是由卡介菌菌體破碎和熱酚處理獲得。所述制備制備包括以下步驟：菌種培養，收集菌膜，破碎菌體，熱酚處理，沉淀，進一步醇沉精制，靜置洗滌后真空干燥箱中干燥，得到卡介菌多糖核酸。卡介菌多糖核酸提取液對CIK細胞有明顯的誘導增殖作用，CD3和CD56雙陽性明顯提高且誘導培養后的CIK細胞對腫瘤生長有較強的殺傷作用，具有臨床應用的潛力。

技術領域

本發明涉及中藥應用技術領域，具體的說是涉及提取中藥材中的有效成分，并在提高CIK細胞增殖速率、CD3和CD56雙陽性和對腫瘤殺傷力的臨床的應用。

背景技術

細胞過繼免疫治療是目前的研究熱點，它是將體外激活的自體或異體免疫效應細胞輸注給患者，殺滅患者體內的腫瘤細胞，并在此基礎上修復、完善機體免疫系統的生物治療方法。CIK細胞(cytokine-induced-killer cells)是一群在體外經過多種細胞因子共同誘導，能夠同時表達兩種膜蛋白分子即CD3和CD56的異質細胞，它不僅具有自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性殺瘤特點，還具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性，具有重要的免疫治療臨床應用價值。因此，CIK細胞的體外大量增殖，即提高其體外增殖速率和對腫瘤細胞的殺傷力，是大規模使用CIK細胞免疫治療的關鍵所在?？ń榫闹饕煞职ㄖ?、多糖、蛋白和核酸，其中多糖(包括脂類)和核酸組分發揮著重要的生理功能?？ń榫募毎诘闹饕煞钟啥嗵?主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸，)和脂類構成。研究表明：可結合人和動物的Toll受體(TLR)的配體大量存在卡介菌細胞壁和其他細胞器上，而且這些配體至少可結合5種Toll受體(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，這些配體和Toll受體結合后會促進樹突狀細胞的成熟，并誘導IL-12的分泌，而IL-12不僅能分泌IFN-γ而且能促進Th0細胞向Th1細胞亞群轉化，從而產生Th1占優勢的非特異性免疫反應。

發明內容

利用卡介菌多糖核酸有機地結合CIK細胞免疫治療在腫瘤治療中的強大優勢，建立卡介菌多糖核酸促進免疫細胞的大量增殖和提高殺傷力的工藝體系，從而間接改善腫瘤患者的生活質量，延長生存期。本發明目的在于提供最優卡介菌多糖核酸提取液濃度在提高CIK細胞增殖速率、CD3和CD56雙陽性和對腫瘤殺傷力方面的應用。

本發明提供了一種促進CIK細胞增殖分化的卡介菌多糖核酸。采用卡介菌菌體破碎和熱酚處理獲得的卡介菌多糖核酸。

本發明提供了一種CIK細胞培養基，包括基礎培養基和卡介菌多糖核酸。

進一步地，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為0.35～35μg/mL。優選的，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為35μg/mL。

進一步地，所述基礎培養基選自RPM1640培養基、DMEM培養基或MEM培養基。

進一步地，所述培養基中還包括IFN-γ和CD3單抗。

本發明提供了一種CIK細胞培養的方法，包括

(1)制備CIK細胞的出發細胞；

(2)配制含卡介菌多糖核酸的培養基，并添加入步驟(1)中的出發細胞，經培養獲得CIK細胞。

進一步地，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為0.35～35μg/mL。優選的，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為35μg/mL。

進一步地，所述培養基中還包括IFN-γ和CD3單抗。

進一步地，步驟(2)的方法包括37℃，5％CO₂培養箱內培養7d，定期更換1/2對應培養液。

本發明還提供了介菌多糖核酸在促CIK細胞增殖分化中的應用。