[發明專利]促進CIK細胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培養基、培養方法和應用有效
| 申請號： | 201611094616.5 | 申請日： | 2016-12-02 |
| 公開（公告）號： | CN106591231B | 公開（公告）日： | 2020-07-03 |
| 發明（設計）人： | 謝昕;陳春;胡華軍;楊連陽 | 申請（專利權）人： | 中國計量大學 |
| 主分類號： | C12N5/0783 | 分類號： | C12N5/0783;C08B37/00 |
| 代理公司： | 浙江千克知識產權代理有限公司 33246 | 代理人： | 黎雙華 |
| 地址： | 310018 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 促進 cik 細胞 增殖 分化 卡介菌 多糖 核酸 培養基 培養 方法 應用 | ||
1.卡介菌多糖核酸在體外培養CIK 細胞中的應用，其特征在于， CIK細胞培養過程包括制備CIK細胞的出發細胞，在出發細胞中加入含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培養基，所述卡介菌多糖核酸的制備方法包括如下步驟：
1)將液體低溫保藏的菌種室溫下溶解，接種于馬鈴薯蘇通培養基，連續培養14-20天；
2)待菌體生長至對數期時，對培養瓶逐瓶檢查后，收集菌膜，洗滌，壓干；
3)將收集的菌體以組織搗碎勻漿機破碎菌體，經熱苯酚，在低速攪拌中保溫處理；
4)將熱酚處理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式離心機高速離心后，上清經0.45μm無菌濾器過濾，即為卡介菌多糖核酸混合物；
5)將所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入藥用乙醇進行醇沉，含醇量為80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通過無水乙醇充分攪拌均勻、離心洗滌3次，然后用乙醚洗滌離心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即為卡介菌多糖核酸提取物；
所述卡介苗多糖核酸的添加量是1ml培養體系中含35μg的卡介菌多糖核酸。
2.一種CIK細胞體外培養的方法，包括
（1）制備CIK細胞的出發細胞；
（2）配制含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培養基，并添加入步驟（1）中的出發細胞，經培養獲得CIK細胞；
所述卡介菌多糖核酸的制備方法包括如下步驟：
1)將液體低溫保藏的菌種室溫下溶解，接種于馬鈴薯蘇通培養基，連續培養14-20天；
2)待菌體生長至對數期時，對培養瓶逐瓶檢查后，收集菌膜，洗滌，壓干；
3)將收集的菌體以組織搗碎勻漿機破碎菌體，經熱苯酚，在低速攪拌中保溫處理；
4)將熱酚處理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式離心機高速離心后，上清經0.45μm無菌濾器過濾，即為卡介菌多糖核酸混合物；
5)將所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入藥用乙醇進行醇沉，含醇量為80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通過無水乙醇充分攪拌均勻、離心洗滌3次，然后用乙醚洗滌離心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即為卡介菌多糖核酸提取物；
所述的卡介苗多糖核酸的使用量是1ml培養體系中含35μg的卡介菌多糖核酸。
3.利用權利要求2所述的CIK細胞體外培養的方法制得的CIK細胞在制備治療腫瘤的藥物中的應用。
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