[發(fā)明專利]一種panD突變基因、編碼蛋白、載體、工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611086457.4
• 申請(qǐng)日: 2016-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN106754845B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余志良;裘娟萍;王姍姍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12P13/06
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明涉及一種panD突變基因、編碼蛋白、載體、工程菌及其應(yīng)用，高產(chǎn)L?天冬氨酸?α?脫羧酶(PanD)的系列重組大腸桿菌是通過易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變改變panD基因的密碼子堿基而獲得。利用高產(chǎn)PanD的基因工程菌可以高效轉(zhuǎn)化L?天冬氨酸來生物法制備β?丙氨酸，其中，編號(hào)為6?85的重組大腸桿菌的PanD酶活達(dá)到250U/L、β?Ala的產(chǎn)量達(dá)8.5g/L左右，比親株分別提高了近4倍和3倍。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種β-丙氨酸的制備，特別涉及一種利用隨機(jī)突變獲得系列panD突變基因、編碼蛋白、載體、工程菌及其應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

β-丙氨酸，又稱β-氨基丙酸，由Ross和Monroe于1972年首次發(fā)現(xiàn)，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，用于泛酸鈣、肌肽、甜味劑等的合成，還被用作水的凈化絮凝劑、電鍍緩蝕劑等。目前，β-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過化學(xué)法合成，根據(jù)合成原料的不同可分為丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亞胺降解法、β-氨基丙腈法等。化學(xué)合成成本高、工藝要求嚴(yán)苛、產(chǎn)生大量腈類等有毒副產(chǎn)物，既不利于產(chǎn)品的分離純化，又會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染。

L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,簡稱PanD)能催化脫去L-天冬氨酸的α-羧基，產(chǎn)生β-丙氨酸和二氧化碳，因此，PanD能被用來生物法制備β-丙氨酸。上世紀(jì)七八十年代，Nakano、Williamson、Cronan等研究團(tuán)隊(duì)先后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能利用細(xì)胞內(nèi)PanD合成β-丙氨酸，并對(duì)該酶的晶體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理進(jìn)行了研究。鑒于天然PanD的活性比較低，直接從自然界中獲得產(chǎn)酶活力高的菌株比較困難，美國NSC技術(shù)有限公司在1996年首次通過基因重組技術(shù)，對(duì)大腸桿菌來源的panD基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，用于拆分DL-天冬氨酸。1999年，德國Dusch等人首次將谷氨酸棒桿菌來源的panD基因分別克隆到大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中表達(dá)。發(fā)明專利(裘娟萍、高麗娟；一種產(chǎn)β-丙氨酸的基因工程菌及其制備與應(yīng)用；申請(qǐng)?zhí)枺?00610155551.0；申請(qǐng)日：2006-12-28)也公開了一株大腸桿菌panD基因在大腸桿菌中重組表達(dá)的菌株(保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO：M206114)，并用于生物法制備β-丙氨酸。

盡管panD基因的重組表達(dá)在一定程度上提高了其在生物法制備β-丙氨酸中的能力，但天然序列和結(jié)構(gòu)的PanD的重組表達(dá)量和活力目前還不夠高，這限制了PanD在生物法制備β-丙氨酸中的應(yīng)用。針對(duì)這個(gè)問題，國內(nèi)外研究人員對(duì)panD基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，以期研究PanD序列與功能的關(guān)系，為提高PanD的活力提供理論基礎(chǔ)。定點(diǎn)突變是一種基于理性設(shè)計(jì)的分子改造。理性設(shè)計(jì)改善酶蛋白的酶學(xué)性質(zhì)需要基于對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)制的掌握，根據(jù)蛋白的空間結(jié)構(gòu)知識(shí)確定關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行取代、插入和缺失突變。因此，有效的理性設(shè)計(jì)需要大量的酶蛋白的信息、豐富的生物、物理和化學(xué)等學(xué)科知識(shí)儲(chǔ)備及開闊的思維方式，往往難度較大；而且定點(diǎn)突變每次只有少數(shù)位點(diǎn)發(fā)生突變，對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的改造有限。相對(duì)而言，基于易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變可在特定編碼序列的多個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)突變，事先不需要對(duì)所改造蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)制有深入了解，故其是一種較為理想的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化方法。到目前為止，還未見用易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變對(duì)PanD進(jìn)行分子改造獲得高活力PanD酶應(yīng)用于β-丙氨酸的制備。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是用易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變改變panD基因的密碼子堿基，從而提高重組大腸桿菌PanD的表達(dá)量，提供一系列panD突變基因和編碼蛋白及提供一種高產(chǎn)PanD、制備β-丙氨酸的方法。

為了達(dá)到本發(fā)明的目的采用的技術(shù)方案是：