[發明專利]一種牦牛與黃牛肉源性鑒別的方法

有效

• 申請號: 201611082789.5
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106755341B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 郭婷婷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 王加貴

本發明提供了一種利用HRM法進行牦牛與黃牛肉源性鑒別的方法，包括以下步驟：1)選取牦牛線粒體12S rRNA基因中和黃牛12S rRNA基因的差異位點，根據選取的差異位點，設計標記引物和標記探針；2)提取待測樣品的全基因組DNA；3)以步驟2)中得到的待測樣品全基因組DNA為模板，加入步驟1)中所述的標記引物和標記探針進行不對稱PCR擴增得到PCR擴增產物；4)用HRM法檢測步驟3)中得到的PCR擴增產物的熔解溫度，繪制熔解曲線，若熔解峰在55～60℃溫度范圍內，則待測樣品為牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范圍內，則待測樣品為黃牛肉。

技術領域

本發明涉及肉類品質檢測領域，尤其涉及一種牦牛與黃牛肉源性鑒別的方法。

背景技術

肉類摻假現已成為我國食品肉類質量安全控制面臨的重要挑戰之一。牦牛肉是高原特有的無污染綠色食品，因其營養價值較高，風味獨特，相應價格與其它牛肉也存在較大差異，這使得市面上出現大量使用普通黃牛肉假冒牦牛肉及其制品的非法現象。

目前，對于肉制品源性成份的常規鑒別方法主要采用基于PCR的核酸水平的檢測，包括DNA探針雜交、RFLP-PCR法(限制性片段長度多態性擴增)、RAPD-PCR法(隨機擴增多態性PCR)等方法。但上述幾種方法存在操作復雜，靈敏度低，重復性差等問題，是基于核酸水平進行肉制品源性成份快速準確鑒別的障礙。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種操作簡單、靈敏度高、重復性好的牦牛與黃牛肉源性鑒別的方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種利用HRM法進行牦牛與黃牛肉源性鑒別的方法，包括以下步驟：

1)選取牦牛和黃牛線粒體12S rRNA基因中和黃牛12S rRNA基因的差異位點，根據選取的差異位點，設計標記引物和標記探針，所述標記引物包括上游引物和下游引物；

2)提取待測樣品的全基因組DNA；

3)以步驟2)中得到的待測樣品全基因組DNA為模板，加入步驟1)中所述的標記引物和標記探針進行不對稱PCR擴增得到PCR擴增產物；

4)用HRM法檢測步驟3)中得到的PCR擴增產物的熔解溫度，繪制熔解曲線，若熔解峰在55～60℃溫度范圍內，則待測樣品為牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范圍內，則待測樣品為黃牛肉；

所述步驟1)和步驟2)之間無時間順序限定。

優選的，所述差異位點的序列如SeqIDNo.1所示。

優選的，所述上游引物的序列如SeqIDNo.2所示，所述下游引物的序列如SeqIDNo.3所示。

優選的，所述標記探針的長度為19～35bp，Tm值介于59～61℃之間，所述標記探針3’末端用錯配堿基封閉。

優選的，所述標記探針的序列如SeqIDNo.4所示。

優選的，所述標記探針的3'端糖環上C6被NH₂封閉，阻止PCR過程探針自身的擴增。

優選的，步驟3)中所述的不對稱PCR擴增的反應體系包括以下組分：以12μL體系計量，上游引物1μL，下游引物0.2μL，探針1μL，待測樣品基因組DNA2μL，2×TaqMix 5μL，ddH₂O1.8μL，LC Green 1μL。

優選的，所述的不對稱PCR擴增的程序為：95℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，45個循環；75℃延伸5min，4℃反應終止。

優選的，步驟4)中HRM法檢測溶解的過程為：將所述PCR擴增產物從35℃升溫至96℃，每升溫0.025℃收集一次熒光信號，反應完成后降溫至35℃。