[發明專利]一種牦牛與黃牛肉源性鑒別的方法有效
| 申請號： | 201611082789.5 | 申請日： | 2016-11-30 |
| 公開（公告）號： | CN106755341B | 公開（公告）日： | 2020-05-08 |
| 發明（設計）人： | 郭婷婷 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務所 11569 | 代理人： | 王加貴 |
| 地址： | 730000 甘肅*** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 牦牛 牛肉 鑒別 方法 | ||
1.一種利用HRM法進行牦牛與黃牛肉源性鑒別的方法，包括以下步驟：
1)根據牦牛線粒體12S rRNA基因和黃牛12S rRNA基因的差異位點，設計標記引物和標記探針，所述標記引物包括上游引物和下游引物；
2)提取待測樣品的全基因組DNA；
3)以所述步驟2)得到的待測樣品全基因組DNA為模板，與所述步驟1)得到標記引物和標記探針進行不對稱PCR擴增，得到PCR擴增產物；
4)用HRM法檢測所述步驟3)得到的PCR擴增產物的熔解溫度，繪制熔解曲線，若熔解峰在55～60℃溫度范圍內，則待測樣品為牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范圍內，則待測樣品為黃牛肉；
所述步驟1)和步驟2)之間無時間順序限定；
所述差異位點的序列如SeqIDNo.1所示；
所述上游引物的序列如SeqIDNo.2所示，所述下游引物的序列如SeqIDNo.3所示；
所述標記探針3'末端用錯配堿基封閉；
所述標記探針的序列如SeqIDNo.4所示。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標記探針的3'端糖環上C6被NH2封閉，阻止PCR過程探針自身的擴增。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的不對稱PCR擴增的反應體系以12μL體系計量，包括以下組分：上游引物1μL，下游引物0.2μL，標記探針1μL，待測樣品全基因組DNA2μL，2×TaqMix 5μL，ddH2O1.8μL，LC Green 1μL。
4.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的不對稱PCR擴增的程序為：95℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，45個循環；75℃延伸5min，4℃反應終止。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中HRM法檢測溶解的過程為：將所述PCR擴增產物從35℃升溫至96℃，每升溫0.025℃收集一次熒光信號，反應完成后降溫至35℃。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述升溫以恒定的速率0.1℃/s進行。
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