[發(fā)明專利]黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611081522.4
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106755339B
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘭成忠;吳瑋;阮宏椿;姚錦愛
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 35100 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 蔡學(xué)俊<國際申請>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明公開了一種黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物及其應(yīng)用。一種基于LAMP技術(shù)檢測黃瓜炭疽病菌的引物組合物由4條特異性引物F3、B3、FIP、BIP組成。本發(fā)明還提供了一種黃瓜炭疽菌LAMP檢測方法，包括以下步驟：1）提取待測樣品DNA；2）使用本發(fā)明提供的引物組合物對待測樣品DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；3）結(jié)果檢測，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光或電泳出現(xiàn)梯形條帶的判斷為陽性，顯色橙色（橘黃色）或沒出現(xiàn)梯形條帶的判斷為陰性。本發(fā)明為黃瓜炭疽病菌提供了新的分子檢測方法及引物組合物，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到黃瓜炭疽病菌，為防治黃瓜炭疽病提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物及其應(yīng)用。可用于黃瓜炭疽病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時(shí)可用于黃瓜炭疽病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。

背景技術(shù)

黃瓜（Cucumis sativus L.）營養(yǎng)豐富，氣味清香，鮮食、熟食均可，是深受廣大生產(chǎn)者和消費(fèi)者喜愛的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值蔬菜作物。黃瓜因其繁多的品種類型和其較強(qiáng)的生長適應(yīng)性，而得到廣泛的應(yīng)用，因而黃瓜是全球性栽培的主要蔬菜之一。隨著我國種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，黃瓜在中國的種植面積和復(fù)種指數(shù)不斷擴(kuò)大，隨之黃瓜病蟲害的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，病蟲害已成為限制黃瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

由葫蘆科刺盤孢菌（Colletotrichum orbiculare）侵染引起的炭疽病是一種重要的黃瓜病害，在全國各地均有發(fā)生，主要危害黃瓜葉片、莖蔓和果實(shí)，全生育期均可發(fā)病，尤以生長后期受害最嚴(yán)重。該病菌侵染力強(qiáng)、繁殖率高，以菌絲體或擬菌核在種子上或隨病殘?bào)w在土壤中越冬，發(fā)病條件一旦適宜，就會造成病害的大面積流行，常造成植株中下部大量葉片干枯，果實(shí)產(chǎn)生病斑，降低品質(zhì)或完全失去商品價(jià)值，使黃瓜產(chǎn)量降低，嚴(yán)重時(shí)病株率達(dá)100%，產(chǎn)量損失40%以上，甚至絕收。近年來該病的發(fā)生有不斷加重的趨勢，然而，針對此病尚無較好的抗病品種和特效農(nóng)藥可以利用，防治難度較大。因此，快速、準(zhǔn)確地在發(fā)病前或初期對病菌的侵染動態(tài)進(jìn)行監(jiān)測，及時(shí)采取有效的防治方法對控制病害在田間和儲運(yùn)中的發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)炭疽病菌的分類與鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征及致病性測定等，這種鑒定方法耗時(shí)較長、程序繁瑣、靈敏度低以及經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，從發(fā)病植株中分離并鑒定病原菌需要數(shù)天時(shí)間，難以做到對病害發(fā)生及時(shí)監(jiān)測和有效控制病原菌的傳播與病害流行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用PCR、血清免疫學(xué)等技術(shù)對病原菌進(jìn)行特異和快速分子檢測的成功例子已越來越多，但這些分子生物學(xué)技術(shù)在一定程度上也存在了一些不足之處。如血清免疫學(xué)檢測技術(shù)在血清的制備過程耗時(shí)耗力，常常受到抗血清質(zhì)量的影響，且可能存在交叉反應(yīng)，特異性較差，容易造成假陽性；PCR快速檢測技術(shù)主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等，PCR技術(shù)檢測時(shí)間較長，需要依靠PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等貴重儀器設(shè)備，不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，上述缺欠限制了這些先進(jìn)方法的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)是由日本榮研公司開發(fā)的一種簡便、快速、準(zhǔn)確及廉價(jià)的核酸高效擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可在60℃~65℃恒溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 對目的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增。在1小時(shí)內(nèi)，能夠?qū)⑸倭靠截悢?shù)的目的基因擴(kuò)增至10⁹~10¹⁰個(gè)拷貝數(shù)。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進(jìn)行檢測，而且還可以通過SYBR GreenⅠ、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)染色后，肉眼識別。由于LAMP反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)，且無需特殊設(shè)備，檢測結(jié)果可由肉眼判斷，極適合于在基層生產(chǎn)部門推廣應(yīng)用，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中報(bào)道較少，關(guān)于黃瓜炭疽病菌的LAMP檢測國內(nèi)外均未見報(bào)道。