[發明專利]黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物及其應用

有效

• 申請號: 201611081522.4
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106755339B
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發明（設計）人: 蘭成忠;吳瑋;阮宏椿;姚錦愛
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 35100 福州元創專利商標代理有限公司
• 代理人: 蔡學俊<國際申請>=<國際公布>=<進入

1.黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物，其特征在于，其核苷酸序列為：

F3: 5’- GGGGCTAACTGCTTGAACAG -3’，

B3: 5’- GGTGCCGTTGTACCTGTT -3’，

FIP: 5’- TGTGCGAAGCATCGTTGCCGGGTAACCAGATTGGTGCTGC -3’，

BIP: 5’- AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCCCATTCTTGACGTGGCCTTA - 3’。

2.一種利用權利要求1所述引物進行黃瓜炭疽病菌LAMP檢測的方法，其特征在于，包括以下具體步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA；

（2）LAMP反應體系的建立：LAMP檢測反應體系為25 μL，以步驟（1）提取的DNA為模板，反應體系包括5 μM F3和B3各1.0 μL，40 μM FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應混合液12.5μL，8 UBst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；

（3）LAMP反應條件：63.5 ℃溫育60 min，85℃滅活5min；

（4）反應結果的測定：采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進行測定：

采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應結束后，在LAMP反應的擴增產物中加入顯色劑SYBR green Ⅰ 1.0 μL，顯色結果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色或橘黃色判斷為陰性；

采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2.0 μL LAMP擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性，沒有出現條帶則判斷為陰性。

3.如權利要求2所述的一種黃瓜炭疽病菌LAMP檢測方法，其特征在于，所述的LAMP反應混合液由以下組分組成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6mol/L甜菜堿，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100。

4.利用權利要求1所述的黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物在黃瓜炭疽病菌的早期診斷和病菌的監測、鑒定上的應用。

5.利用權利要求2所述的黃瓜炭疽病菌LAMP檢測方法在黃瓜炭疽病菌的早期診斷和病菌的監測、鑒定上的應用。