[發明專利]一株高產海藻糖合酶的假單胞菌及其發酵產酶方法

有效

• 申請號: 201611080880.3
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106754486B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 王興吉;劉文龍;曹世源;張杰
• 申請（專利權）人: 山東隆科特酶制劑有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/90;C12R1/38
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明公開了一株高產海藻糖合酶的假單胞菌及其發酵產酶方法，屬于微生物或酶領域，所述菌株具體為假單胞菌菌株(Pseudomonas sp.)CSY?67，保藏編號為CGMCC No.13154。該菌株通過液體50L罐深層發酵，經補料，發酵培養80h，產酶平均水平為39575U/mL。本發明建立的液態發酵海藻糖合酶的方法，生產的海藻糖合酶最適pH范圍為7.5?8.5，最適作用溫度范圍為35℃?45℃，在60℃保溫1h后剩余酶活為88％，80℃保溫2h后剩余酶活為59.5％，具有良好的耐熱性，可廣泛應用海藻糖的工業化生產中。

技術領域

本發明屬于微生物或酶領域，具體涉及一株高產海藻糖合酶的假單胞菌及其發酵產酶方法。

背景技術

海藻糖是由兩分子葡萄糖以1，1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，廣泛存在于細菌、酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲、無脊椎動物等生物體體內。海藻糖對生物體具有非常重要的生物學意義，它是能源和碳源的儲備物，是蛋白質和生物膜分子在脫水、高溫、氧自由基、低溫等惡劣環境中的穩定劑和保護劑，是信號傳感復合物和生長調控因子，還是某些細菌細胞壁的組分之一。由于海藻糖具有甜度適中、性質穩定、不易分解、無還原性等特殊性質，以及其保護生物大分子（生物膜、蛋白質、DNA）免受干燥、高溫、低溫、過氧等環境壓力破壞的獨特功能，因此該雙糖的應用價值十分巨大，已經被廣泛應用于食品加工業、醫藥業、農業、生化制品業和化妝品產業中。

海藻糖合酶（trehalose synthase）是由日本生化研究所在1995年首次發現的，其能直接將麥芽糖轉化為海藻糖，此后，在脂肪桿菌（Pimelobacter sp. R48）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida H262）和一些嗜熱菌中都發現了海藻糖合酶，可喜的是該酶能特異性的催化麥芽糖轉化為海藻糖，不作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽寡糖、蔗糖、異麥芽糖、異麥芽寡糖等。

但是由于受酶活及酶適用條件的制約，目前現有技術海藻糖合酶仍不能滿足工業生產的需求，所以選育一株高產海藻糖合酶的假單胞菌菌株，其發酵產品具有良好的耐熱性，生產成本低廉，對大規模推進各行業的機械化具有重大意義。

發明內容

本發明的目的是提供一株高產海藻糖合酶的假單胞菌及其發酵產酶方法，在確保假單胞菌發酵高產海藻糖合酶穩定性的同時，顯著提高海藻糖合酶良好的耐熱性。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一株高產海藻糖合酶的假單胞菌，所述菌株為假單胞菌（Pseudomonas sp.）CSY-67，菌株保藏號為CGMCC No. 13154。

所述假單胞菌CSY-67發酵所產的海藻糖合酶最適作用pH范圍為7.5-8.5，最適作用溫度范圍為35℃-45℃。

本發明的另一目的在于提供上述假單胞菌CSY-67的發酵產酶方法，主要包括以下步驟：

斜面培養：挑取一環假單胞菌CSY-67接種于固體斜面培養基，37℃下恒溫培養48h，得一級種子；

搖瓶培養：將一級種子取一環接入種子培養基中，恒溫37℃，搖床轉速200 r/min條件下培養48 h，得二級種子液；

種子罐培養：將二級種子液按照接種量5%(v/v)的比例接入種子罐培養基中，恒溫37℃，轉速200-800 r/min條件下培養14-18 h；

發酵罐培養：將種子罐中的種子液按照接種量5%(v/v)的比例接入發酵罐培養基，恒溫 37℃，轉速200-800 r/min，設置通風量：0h至5h 為0.25 vvm、5h至20h為0.5 vvm、20h至發酵結束為1.0 vvm，發酵全程利用補料培養基控制發酵液pH值為6.5，發酵至酶活增長緩慢，菌體自溶嚴重時結束發酵，發酵周期為75-85 h，得到最終發酵液；