[發(fā)明專利]一株高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌及其發(fā)酵產(chǎn)酶方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201611080880.3 | 申請日： | 2016-11-30 |
| 公開（公告）號： | CN106754486B | 公開（公告）日： | 2020-06-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王興吉;劉文龍;曹世源;張杰 | 申請（專利權(quán)）人： | 山東隆科特酶制劑有限公司 |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;C12N9/90;C12R1/38 |
| 代理公司： | 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617 | 代理人： | 栗華楠 |
| 地址： | 276400 *** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 高產(chǎn) 海藻 糖合酶 假單胞菌 及其 發(fā)酵 方法 | ||
1.一株高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌，其特征在于：所述菌株為假單胞菌（
2.如權(quán)利要求1所述一株高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌，其特征在于：所述假單胞菌CSY-67發(fā)酵所產(chǎn)的海藻糖合酶最適作用pH范圍為7.5-8.5，最適作用溫度范圍為35℃-45℃。
3.如權(quán)利要求1-2任一所述的高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，主要包括以下步驟：
斜面培養(yǎng)：挑取一環(huán)假單胞菌CSY-67接種于固體斜面培養(yǎng)基，37℃下恒溫培養(yǎng)48 h，得一級種子；
搖瓶培養(yǎng)：將一級種子取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，恒溫37℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，得二級種子液；
種子罐培養(yǎng)：將二級種子液按照接種量5%體積比(v/v)的比例接入種子罐培養(yǎng)基中，恒溫37℃，轉(zhuǎn)速200-800 r/min條件下培養(yǎng)14-18 h；
發(fā)酵罐培養(yǎng)：將種子罐中的種子液按照接種量5%體積比(v/v)的比例接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基，恒溫 37℃，轉(zhuǎn)速200-800 r/min，設(shè)置通風量：0h至5h 為0.25 vvm、5h至20h為0.5 vvm、20 h至發(fā)酵結(jié)束為1.0 vvm，發(fā)酵全程利用補料培養(yǎng)基控制發(fā)酵液pH值為6.5，發(fā)酵至酶活增長緩慢，菌體自溶嚴重時結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵周期為75-85 h，得到最終發(fā)酵液；
將最終發(fā)酵液通過提取與精制方法，獲得海藻糖合酶成品液體酶制劑。
4.如權(quán)利要求3所述的高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，其特征在于：
所述固體斜面培養(yǎng)基質(zhì)量體積比（g/L）：蛋白胨 12，酵母膏 6，瓊脂 15，氯化鈉 1，余量為水，pH 7.0，121℃滅菌20 min；
所述種子培養(yǎng)基質(zhì)量體積比（g/L）：麥芽糖漿 40，蛋白胨 5，酵母膏 5，硫酸鈉 0.8，硫酸鎂 0.5，氯化鈣 0.1，磷酸氫二鈉 0.5，余量為水，pH7.0，121℃滅菌20 min；
所述種子罐培養(yǎng)基質(zhì)量體積比（g/L）：麥芽糖漿 40，葡萄糖 10，酵母膏 15，玉米漿 5，KH2PO4 1.5，氯化鈣 0. 1，余量為水，pH 7.0，121-123℃滅菌30 min；
所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基質(zhì)量體積比（g/L）：麥芽糖 80，蛋白胨 10，酵母膏 5，硫酸鎂 0.5，氯化鈣 0.1，磷酸氫二鉀 0.3，余量為水，pH7.0，121-123℃滅菌30 min；
所述補料瓶培養(yǎng)基質(zhì)量體積比（g/L）：麥芽糖漿450，KH2PO4 5，玉米漿 8，CaCl2 5，余量為水，pH 4.0，121-123℃滅菌30 min。
5.如權(quán)利要求3所述的高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，其特征在于：所述海藻糖合酶的提取與精制方法如下：
先將所述最終發(fā)酵液加1%甲苯進行細胞破壁處理，再加入1~5%珍珠巖助濾劑，壓濾得到澄清壓濾酶液；
用20000分子量超濾膜對所述澄清壓濾酶液進行超濾濃縮,得到濃縮液；
在所述濃縮液中加入20%質(zhì)量體積比（m/v）穩(wěn)定劑、0.45%質(zhì)量體積比（m/v）防腐劑，調(diào)節(jié)pH7.5，然后進行過濾除菌，即得到海藻糖合酶成品液體酶制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，其特征在于：所述穩(wěn)定劑為甘油，所述防腐劑為質(zhì)量比為1：2的山梨酸鉀和苯甲酸鈉。
7.如權(quán)利要求3所述的高產(chǎn)海藻糖合酶的假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)酶方法，其特征在于：
所述提取與精制方法制得的海藻糖合酶成品液體酶制劑產(chǎn)品。
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