[發明專利]一種白僵菌分離擴繁方法

在審

• 申請號: 201611080117.0
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106834123A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 青學剛;李文學;陳寶瑞;童文;孫佩;肖金樹;劉剛;張友洪;周安蓮;肖文福;劉俊鳳;尹紅;王曉芬;王皓
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院蠶業研究所;四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所;四川省南充市桃園生物化學研究開發有限公司
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 成都市集智匯華知識產權代理事務所(普通合伙)51237
• 代理人: 李華,溫黎娟

技術領域

本發明涉及微生物培養技術領域，具體涉及一種白僵菌分離擴繁方法。

背景技術

白僵菌是一種子囊菌類的蟲生真菌，主要種類包括球孢白僵菌和布氏白僵菌等，常通過無性繁殖生成分生孢子，菌絲有橫隔有分枝。白僵菌可以侵入6個目15科200多種昆蟲、螨類的蟲體內大量繁殖，同時產生白僵素(非核糖體多肽類毒素)、卵孢霉素(苯醌類毒素)和草酸鈣結晶，這些物質可引起昆蟲中毒，打亂新陳代謝以致死亡。其中，球孢白僵菌為子囊菌類的真菌，可工業化培養生產，人們利用其產生的分子孢子可加工成微生物殺蟲劑。

中藥白僵蠶也是基于白僵菌的以上特性產生的，昆蟲家蠶的幼蟲在未吐絲前，因感染白僵菌而發病致死，蟲體僵化即為白僵蠶，外用其藥，味咸、辛，性平，可治面上黑及礙容性疾病，白僵蠶含有氨基酸和活性絲光素，有營養皮膚和美容作用；所含蛋白質有刺激上皮脂腺，調節性激素分泌的作用，因而對女性性激素分泌失調引起的黃褐斑有一定療效；含維生素E，能清除自由基，抗脂質氧化形成的老年斑；所含的活性絲光素能促使皮膚細胞新生，調節皮脂，改善皮膚微循環，可增白防曬，消除色素沉著，保持皮膚彈性。人工培養白僵菌，并采用白僵菌感染家蠶即能得到工業化的白僵蠶產品，因此，白僵菌的分離擴繁生產過程尤為重要。然而，現有白僵菌的分離及擴繁生產周期較長，在生產過程中易受雜菌污染，白僵菌產量不高，質量并不穩定，成本也較高。

發明內容

有鑒于此，本申請提供一種白僵菌分離擴繁方法，所述方法的工藝簡單，生產成本低，生產周期短，提高了生產效率，顯著減少雜菌污染，成功率高，擴繁后的白僵菌質量穩定。

為解決以上技術問題，本發明提供的技術方案是一種白僵菌分離擴繁方法，所述方法包括以下步驟：

(1)白僵菌孢子液制備：用無菌接種環從白僵蠶表面挑取3—4環分生孢子粉，置于無菌水中，振蕩10—15min，直至均勻，得白僵菌孢子液；

(2)分離純化培養：將步驟(1)得到的白僵菌孢子液接種于選擇培養基中，在25—26℃條件下培養4—6天，得白僵菌菌種，所述選擇培養基的組分包括：PDA培養基，補充龍膽紫、苯菌靈、脫氧膽酸鈉、頭孢霉素、放線菌酮、多果定中的至少一種；

(3)一次擴大培養：將步驟(2)得到的白僵菌菌種接種于液體培養基中，在24—25℃、振蕩條件下培養2—3天，得到白僵菌菌絲體，所述液體培養基的組分按重量份數計包括：葡萄糖4—6份、馬鈴薯汁5—10份、蛋白胨2—10份、頭孢霉素1—2份、BaCl₂1—2份、CaCl₂1—2份、無菌水20—80份；

(4)二次擴大培養：將步驟(3)得到的白僵菌菌絲體接種于固體培養基中，在25—26℃條件下培養5—9天，得到擴繁后的白僵菌，所述固體培養基的組分按重量份數計包括：葡萄糖2—5份、豆粕3—8份、玉米粉10—20份。

優選的，步驟(2)中所述選擇培養基的組分包括：PDA培養基，補充苯菌靈、脫氧膽酸鈉、頭孢霉素中的至少一種。

更為優選的，步驟(2)中所述選擇培養基的組分按重量份數計包括：PDA培養基，補充脫氧膽酸鈉2—4份、頭孢霉素3—5份。

更為優選的，步驟(2)中所述選擇培養基的組分按重量份數計包括：PDA培養基，補充苯菌靈1—2份、脫氧膽酸鈉2—4份。

優選的，步驟(3)所述液體培養基的組分按重量份數計包括：葡萄糖5份、馬鈴薯汁7份、蛋白胨8份、頭孢霉素2份、BaCl₂1份、CaCl₂2份、無菌水70份。

優選的，步驟(4)所述固體培養基的組分按重量份數計包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。

優選的，所述白僵菌孢子液制備步驟之前，先將白僵蠶表面用75％酒精消毒，再置于無菌培養皿中培養4—5天，直至白僵蠶表面長出菌絲和分生孢子。

優選的，步驟(2)所述選擇培養基的制備方法為：取滅菌后冷卻至65—68℃的PDA培養基，加入龍膽紫、苯菌靈、脫氧膽酸鈉、頭孢霉素、放線菌酮、多果定中的至少一種，待冷卻至40—45℃時，再加入硫酸卡那霉素，待所述選擇培養基凝固即可。

優選的，所述二次擴大培養的濕度控制在92—94％。

其中，本申請技術方案所述的白僵菌為球孢白僵菌。