[發(fā)明專利]一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611080117.0
• 申請(qǐng)日: 2016-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN106834123A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 青學(xué)剛;李文學(xué);陳寶瑞;童文;孫佩;肖金樹;劉剛;張友洪;周安蓮;肖文福;劉俊鳳;尹紅;王曉芬;王皓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所;四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所;四川省南充市桃園生物化學(xué)研究開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/02
• 分類號(hào): C12N1/02;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 成都市集智匯華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)51237
• 代理人: 李華,溫黎娟

1.一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

(1)白僵菌孢子液制備：用無(wú)菌接種環(huán)從白僵蠶表面挑取3—4環(huán)分生孢子粉，置于無(wú)菌水中，振蕩10—15min，直至均勻，得白僵菌孢子液；

(2)分離純化培養(yǎng)：將步驟(1)得到的白僵菌孢子液接種于選擇培養(yǎng)基中，在25—26℃條件下培養(yǎng)4—6天，得白僵菌菌種，所述選擇培養(yǎng)基的組分包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充龍膽紫、苯菌靈、脫氧膽酸鈉、頭孢霉素、放線菌酮、多果定中的至少一種；

(3)一次擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟(2)得到的白僵菌菌種接種于液體培養(yǎng)基中，在24—25℃、振蕩條件下培養(yǎng)2—3天，得到白僵菌菌絲體，所述液體培養(yǎng)基的組分按重量份數(shù)計(jì)包括：葡萄糖4—6份、馬鈴薯汁5—10份、蛋白胨2—10份、頭孢霉素1—2份、BaCl₂1—2份、CaCl₂1—2份、無(wú)菌水20—80份；

(4)二次擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟(3)得到的白僵菌菌絲體接種于固體培養(yǎng)基中，在25—26℃條件下培養(yǎng)5—9天，得到擴(kuò)繁后的白僵菌，所述固體培養(yǎng)基的組分按重量份數(shù)計(jì)包括：葡萄糖2—5份、豆粕3—8份、玉米粉10—20份。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：步驟(2)中所述選擇培養(yǎng)基的組分包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充苯菌靈、脫氧膽酸鈉、頭孢霉素中的至少一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：步驟(2)中所述選擇培養(yǎng)基的組分按重量份數(shù)計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充脫氧膽酸鈉2—4份、頭孢霉素3—5份。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：步驟(2)中所述選擇培養(yǎng)基的組分按重量份數(shù)計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充苯菌靈1—2份、脫氧膽酸鈉2—4份。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：步驟(3)所述液體培養(yǎng)基的組分按重量份數(shù)計(jì)包括：葡萄糖5份、馬鈴薯汁7份、蛋白胨8份、頭孢霉素2份、BaCl₂1份、CaCl₂2份、無(wú)菌水70份。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：步驟(4)所述固體培養(yǎng)基的組分按重量份數(shù)計(jì)包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：所述白僵菌孢子液制備步驟之前，先將白僵蠶表面用75％酒精消毒，再置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4—5天，直至白僵蠶表面長(zhǎng)出菌絲和分生孢子。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：步驟(2)所述選擇培養(yǎng)基的制備方法為：取滅菌后冷卻至65—68℃的PDA培養(yǎng)基，加入龍膽紫、苯菌靈、脫氧膽酸鈉、頭孢霉素、放線菌酮、多果定中的至少一種，待冷卻至40—45℃時(shí)，再加入硫酸卡那霉素，待所述選擇培養(yǎng)基凝固即可。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白僵菌分離擴(kuò)繁方法，其特征在于：所述二次擴(kuò)大培養(yǎng)的濕度控制在92—94％。