[發(fā)明專(zhuān)利]一種酶法水解三文魚(yú)膠原制備抗氧化肽與抗凍肽的工藝

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611076917.5
• 申請(qǐng)日: 2016-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108118077A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何海倫;吳日幫;楊興昊;劉丹;武翠玲;張姜;黃嘉豐;廖斌強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P21/06
• 分類(lèi)號(hào): C12P21/06;C12N9/52;C07K14/78;C07K1/34;C07K1/16
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本發(fā)明設(shè)計(jì)一種酶解膠原蛋白同時(shí)制備抗氧化肽與抗凍肽的工藝，其方法是以三文魚(yú)皮為原料提取膠原蛋白，利用Vibrio sp.SQS2?3發(fā)酵所得的胞外蛋白酶粗酶液將其水解成短肽溶液，通過(guò)3000 Da超濾管4500×g離心超濾45min后獲得具有保護(hù)肌球蛋白和減緩其Ca²⁺?ATPase活性在反復(fù)凍融中下降作用的抗凍肽，通過(guò)Sephadex LH?20凝膠過(guò)濾層析分離下層超濾組份后，獲得具有清除DPPH自由基、羥自由基以及對(duì)DNA氧化損傷具有一定抑制的能力，并且在氧自由基吸收能力檢測(cè)中顯示出濃度依賴(lài)的抗氧化活性的抗氧化肽。LC?MS技術(shù)鑒定出該抗氧化組分含有19條多肽。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用微生物蛋白酶酶解三文魚(yú)皮膠原同時(shí)制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

我國(guó)海洋與淡水水域面積廣闊，水產(chǎn)資源豐富，占世界水產(chǎn)品總量的36%。隨著漁業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展也得以推動(dòng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有大約兩千萬(wàn)噸富含蛋白質(zhì)的魚(yú)類(lèi)副產(chǎn)品，如魚(yú)骨、魚(yú)皮、魚(yú)鰭和魚(yú)鱗等，在加工過(guò)程中產(chǎn)生，它們大部分被直接掩埋丟棄或用于制作動(dòng)物飼料、魚(yú)粉等低值產(chǎn)品，不僅造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，還直接導(dǎo)致環(huán)境污染。因此，開(kāi)發(fā)出對(duì)水產(chǎn)加工業(yè)產(chǎn)生的廢棄物進(jìn)行高附加值利用的工藝，使其變廢為寶，成為了緩解資源與環(huán)境的重要手段。

膠原蛋白廣泛存在于動(dòng)物的表皮和骨組織中，其組成單位為原膠原，每個(gè)原膠原分子有三條肽鏈組成，肽鏈為α-螺旋結(jié)構(gòu)，以平行右手螺旋形式形成三股螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白在氨基酸組成上最重要的特點(diǎn)是以“Gly-X-Y”的形成重復(fù)排列，即每隔兩個(gè)氨基酸殘基出現(xiàn)一個(gè)甘氨酸，X與Y為其它的氨基酸殘基。傳統(tǒng)上商業(yè)應(yīng)用的膠原蛋白多來(lái)自于動(dòng)物皮骨，但因瘋牛癥、口蹄疫等疾病，使人們對(duì)牲畜膠原制品安全性產(chǎn)生疑慮。同時(shí)由于宗教和習(xí)俗等因素，部分地區(qū)與群眾拒絕使用牲畜膠原制品。許多水生生物中膠原含量非常豐富，也具有一些不同于哺乳動(dòng)物源膠原蛋白的特點(diǎn)，水產(chǎn)動(dòng)物膠原蛋白中羥脯氨酸的含量比陸地動(dòng)物膠原蛋白低得多，這使得水產(chǎn)動(dòng)物膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性更低，在低溫下也更易溶于中性鹽溶液或酸性溶液，更容易制得可溶性膠原，為膠原的提取和應(yīng)用提供了有利條件。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有研究報(bào)道利用副產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)成功制備出具有不同生物活性的肽類(lèi)分子，成為食品、醫(yī)藥、護(hù)膚領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，其中包括抗氧化肽、降血壓肽、抗菌肽、抗凍肽等。從自然界中發(fā)現(xiàn)的生物活性肽種類(lèi)有限，且提取量少，難度大，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)，而大分子蛋白質(zhì)中具有大量不同的氨基酸序列信息，通過(guò)生物技術(shù)使蛋白質(zhì)和多肽斷裂，釋放出不同結(jié)構(gòu)的肽段，這為大規(guī)模獲得潛在的生物活性肽提供了新的研究思路。

膠原蛋白作為一種數(shù)量豐富、來(lái)源廣泛的低值蛋白，結(jié)合生物酶工程技術(shù)，開(kāi)發(fā)一種對(duì)膠原蛋白高值化綜合利用的工藝，對(duì)膠原蛋白進(jìn)行水解，獲得介于蛋白質(zhì)與氨基酸之間的低聚活性膠原肽，在醫(yī)藥、護(hù)膚、保健、食品領(lǐng)域有著巨大的潛在市場(chǎng)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有生物酶解制備活性肽技術(shù)的不足，提供了一種利用微生物胞外蛋白酶酶解從三文魚(yú)皮中提取的膠原蛋白，從不同組份中同時(shí)制備分離出具有不同生物活性的膠原肽的工藝方法，使之達(dá)到資源綜合利用的目的。

步驟如下：

（一）微生物胞外蛋白酶的制備：

1、將產(chǎn)胞外蛋白酶細(xì)菌Vibrio sp. SQS2-3菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，在17°C水平搖床中震蕩培養(yǎng)2-3天，轉(zhuǎn)速為200 rpm，然后按2%（v/v）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在17°C水平搖床中震蕩培養(yǎng)5天，轉(zhuǎn)速為180 rpm，制得發(fā)酵液；