[發(fā)明專利]一種酶法水解三文魚膠原制備抗氧化肽與抗凍肽的工藝

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• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN108118077A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 何海倫;吳日幫;楊興昊;劉丹;武翠玲;張姜;黃嘉豐;廖斌強
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C12N9/52;C07K14/78;C07K1/34;C07K1/16
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1.一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：其以三文魚皮為原料提取膠原蛋白，利用微生物發(fā)酵所得的胞外蛋白酶將膠原蛋白水解成短肽，經(jīng)過分離后獲得抗氧化肽與抗凍肽組份。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的膠原蛋白提取方法為利用80°C水浴處理新鮮去肉三文魚皮30 min，通過透析與冷凍干燥得到膠原蛋白固體。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的微生物為從海南省海口市美蘭區(qū)渠口鎮(zhèn)的潮間帶海水中分離鑒定所得Vibrio sp. SQS2-3。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的微生物胞外蛋白酶制備方法為將細菌Vibrio sp. SQS2-3菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，在17°C水平搖床中震蕩培養(yǎng)2-3天，轉速為200 rpm，然后按2%（v/v）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在17°C水平搖床中震蕩培養(yǎng)5天，轉速為180 rpm，制得發(fā)酵液；將發(fā)酵液倒入離心管中進行冷凍超速離心，離心條件為10000 × g，4°C，30 min，然后收集上清，倒入新的離心管中，12000 × g，4°C離心15 min，重復2-3遍，直到上清沉淀較少；收集上清液加入到分子截留量為8000-14000 Da的透析袋中，用透析袋夾密封，然后放置在濃度為20 mM，pH 7.8的Tris-HCl中冰浴透析2 h，然后更換新的Tris-HCl繼續(xù)冰浴透析2 h，最后用新的Tris-HCl浸泡透析袋，并放置在4°C冰箱中透析24 h，獲得粗酶液。

5.根據(jù)權利要求4所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：蛋白胨0.5份，酵母粉0.1份，F(xiàn)e₂(PO₄)₃ 0.001份，人工海水100份，pH為7.8。

6.根據(jù)權利要求4所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：玉米粉1份，麩皮0.5份，豆粕1份，Na₂HPO₄ 0.05份，KH₂PO₄ 0.02份，CaCl₂ 0.05份，Na₂CO₃ 0.05份，人工海水50份，pH為7.5-8.0。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的短肽制備方法為根據(jù)酶與底物比例1：10（ml/mg）將三文魚皮膠原蛋白與粗酶液混合，置于37°C，100 rpm恒溫水平搖床中酶解120 min；將酶解液置于95°C水浴鍋中加熱10 min使酶失活，冷卻至室溫后，10000 × g，4°C離心5 min去除變性大分子蛋白，收集上清，獲得膠原短肽。

8.根據(jù)權利要求1所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的抗氧化肽與抗凍肽組份分離方法如下

a. 取權利要求7中獲得的膠原短肽加入到分子截留量為3 kDa的超濾管中，4500 × g離心45 min，分別收集超濾管上下層濾液，上層為抗凍肽組份；

b. 取上述下層濾液，使用Sephadex LH-20凝膠色譜柱對下層濾液進行分子篩層析：以兩倍體積超純水作為流動相平衡色譜柱（16 × 600 mm），按柱床體積3-5%上樣，用超純水洗脫3-4倍體積，流速為1 ml/min，檢測220 nm吸光度，收集活性峰，并進行真空冷凍干燥，獲得抗氧化肽組份。

9.根據(jù)權利要求1或8所述的一種同時制備抗氧化肽與抗凍肽的方法，其特征在于：所述的抗氧化肽具有清除DPPH自由基、羥自由基以及對DNA氧化損傷具有一定抑制的能力，并且在氧自由基吸收能力檢測中顯示出劑量效應。