[發明專利]一種植物線蟲永久玻片的制作方法

在審

• 申請號: 201611073300.8
• 申請日: 2016-11-29
• 公開（公告）號: CN106614520A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 顧建鋒;何潔;劉樂樂;陳先鋒;段維軍
• 申請（專利權）人: 寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: A01N1/00
• 分類號: A01N1/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 王加貴

技術領域

本發明涉及植物線蟲標本制作技術領域，具體為一種植物線蟲永久玻片的制作方法。

背景技術

植物線蟲屬于無脊椎動物中的線蟲門，能寄生于植物根、莖、葉、果實、種子等部位，其種類繁多、危害嚴重。據不完全統計，全世界每年因植物線蟲造成的農林作物經濟損失在數千億元以上。我國2007年公布的對外植物檢疫性有害生物名錄中，有20種(屬)的線蟲為檢疫性線蟲，其實際種數多達200種以上。

在植物線蟲檢測鑒定研究工作中，一般首先必須制作臨時玻片，對線蟲的形態結構進行初步觀察和攝影，并對各種數據進行測計。隨后，需進一步將樣品制成永久玻片，作為實驗室的實物標本，可作為檢疫實驗室的截獲證據，也可供教學或科研需要，尤其對鑒定的新種，必須要求有模式標本。

一般線蟲永久玻片制作過程較為復雜，制作步驟多，涉及標本的殺死、固定、脫水、制片等步驟。而且需耗時較長，一般需要5～6周。公開號為CN102640742A的中國專利公開了一種對傳統的永久玻片制作方法改進的技術方案，但該方案仍需用2種脫水液，且用時需20天左右。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供簡易的線蟲永久玻片制作方法，其方法便捷、可操作性強、效果好。

具體的技術方案如下：

一種植物線蟲永久玻片的制作方法，包括以下步驟：

a、將含有線蟲的水溶液在55-60℃溫浴2-3min后離心，分離水層得到線蟲液，將所述線蟲液在固定液中浸泡24h以上；

b、將含有線蟲的固定液離心，分離上層固定液得到固定后的線蟲，將固定后的線蟲與1.5～2.5ml甘油水溶液混合置于24孔細胞培養皿中，再將所述24孔細胞培養皿在35℃～40℃條件下恒溫放置40h～50h，得到完全脫水浸泡于甘油中的線蟲；其中，所述甘油水溶液包括體積比為1:15～25的甘油與水；

c、在載玻片上滴加甘油，將所述完全脫水浸泡于甘油中的線蟲移至載玻片的甘油滴中，在甘油滴兩邊放蠟塊，加蓋玻片，加熱至蠟塊融化后冷卻。

本發明中，所述線蟲固定液包括體積比為5～15:1～5:65～94的40wt％甲醛、甘油和水。

本發明步驟a或步驟b中，所述離心的轉速獨立地為2000～4000r/min，離心時間獨立地為1～5min。

本發明步驟c中，移至甘油滴中央的線蟲為已完全脫水的雌、雄線蟲各若干條，排列均勻。

步驟c中，所述加熱步驟具體為，將含有蠟塊的玻片置于50～70℃的加熱板上加熱，所述加熱的時間為20～40s。

步驟c中，玻片冷卻后，在所述玻片上貼上標簽，所述標簽上包括樣品號、寄主、產地、制作日期。

與現有技術相比，本發明的優點在于：

本發明簡化了永久玻片制作的復雜程序，在脫水過程中只需要使用一種脫水液，其操作過程和所需材料比常規線蟲永久玻片制片方法簡化了許多，降低了制作難度。本發明植物線蟲永久玻片簡易制作方法，從殺死、固定、脫水和制片的全過程僅需約3d，操作簡單、快捷，對各種常見植物線蟲都能獲得較好的永久玻片。

具體實施方式

下面將結合本發明中的實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

一種植物線蟲永久玻片的制作方法，包括以下步驟：

線蟲的殺死與固定：將含有線蟲的水溶液溫浴后離心，分離水層得到微量線蟲液，在線蟲液中加入固定液浸泡，殺死和固定線蟲。

本發明中目標線蟲需是活的，最好是剛從土壤或植物組織中分離出的，若分離出的目標線蟲放置過久而沒有固定或固定時間短，會使線蟲變形。將含有線蟲的水溶液溫浴以殺死線蟲。溫浴溫度優選為55-60℃，進一步為56-58℃，溫浴時間優選為2-3min。將溫浴后的含有線蟲的水溶液離心，使線蟲和水分離。所述離心的轉速為2000～4000r/min，優選為2500～3500r/min，進一步為3000r/min；離心時間為1～5min，優選為2～4min，更優選為3min。