[發明專利]小酸漿的分子特異性標記引物和檢測方法

有效

• 申請號: 201611071090.9
• 申請日: 2016-11-29
• 公開（公告）號: CN106636369B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 馮尚國;王慧中;焦凱麗;姜夢瑩;盧江杰;沈晨佳
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 杜軍

本發明涉及小酸漿的分子特異性標記引物，以及一種利用該特異性引物對小酸漿進行快速檢測的方法。所述引物序列為：上游引物XSJF:5’?TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG?3’；下游引物XSJR:5’?CCACCAGAATGTACTTGTTACG?3’。運用本發明設計的特異性引物XSJF/XSJR，通過PCR方法，可以實現小酸漿的快速準確鑒別。XSJF/XSJR是小酸漿專一性擴增引物，若為其他酸漿屬植物樣品，則為陰性反應；本發明方法簡便，靈敏度高，結果準確，且耗時短。

技術領域

本發明涉及一種小酸漿Physalis minima L.的分子特異性標記引物，以及利用該特異性標記引物對小酸漿進行快速檢測的方法。

背景技術

小酸漿Physalis minima L.為茄科酸漿屬Physalis一年生草本植物，在我國多地都有分布，其中云南、廣東、廣西及四川分布較多。主要以野生為主，多生長在海拔1000-1300米的山坡上。在我國，小酸漿是一種民間傳統中藥材，在《全國中草藥匯編》中有記載。其味苦、涼，具有清熱、利尿、抗炎、抗氧化、降血糖及細胞毒性等功效，主要用于咽喉腫痛、支氣管炎、感冒發熱、膽囊炎、血尿、濕疹及癤腫等的治療。小酸漿葉片卵形或卵狀披針形，邊緣波狀或有少數粗齒，兩面脈上有柔毛。花生短柔毛，花萼鐘狀，果萼近球狀或卵球狀，果實球狀，直徑約6毫米。其形態學特征與酸漿屬植物毛酸漿、苦蘵及酸漿非常相似。利用傳統鑒別方法很難將它們區分開，這也阻礙了小酸漿藥材的安全利用和保護。

DNA分子標記技術彌補和克服了傳統形態學分類方法的一些缺陷和難題，可以通過基因序列差異比較分析為植物鑒別、系統分類提供直接的證據。常規的分子標記技術譬如RAPD、ISSR及SRAP等采用通用隨機引物進行PCR擴增，其PCR產物指紋圖譜比較復雜、重復性較差、且在物種鑒定中的應用性不強。特異性分子標記技術的引物具有較強的專一性，能夠進行特異性擴增，且穩定性較好。該方法技術具有快速、簡便、成本低、準確度高的特點，在植物種類鑒定中具有較好的應用前景。目前尚未有特異性分子標記技術應用于小酸漿物種檢測的研究報道。

發明內容

本發明的第一個目的是提供小酸漿Physalis minima L.的分子特異性標記引物，該特異性標記引物序列如下：

上游引物XSJF:5’-TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG-3’,如SEQ ID NO.1所示；

下游引物XSJR:5’-CCACCAGAATGTACTTGTTACG-3’,如SEQ ID NO.2所示。

該引物組合是采用PCR技術，經過大量篩選實驗，獲得小酸漿特異性DNA片段，通過切膠回收、TA克隆、測序，獲得該DNA序列，在此基礎上設計小酸漿特異性標記引物，以該引物對小酸漿及其他酸漿屬相近物種進行PCR擴增，只與小酸漿樣本DNA發生反應，獲得444bp大小的特異性片段，而不與其他酸漿屬植物樣品反應。

本發明的第二個目的是提供上述分子特異性標記引物對小酸漿進行檢測的方法。所述方法為：采用上述引物組合(XSJF/XSJR)作為特異性擴增引物，以待測酸漿屬植物樣品基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若電泳結果出現分子量為444bp大小的特異性片段，則待測酸漿屬植物樣品為小酸漿，反之則不是。

具體的，所述方法如下：

(1)基因組DNA的提取：取待測酸漿屬植物樣品新鮮葉片，加液氮研磨至粉末，然后利用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取待測酸漿屬植物樣品的基因組DNA。

(2)PCR擴增：以步驟(1)提取的待測酸漿屬植物樣品基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物(XSJF/XSJR)作為擴增引物，進行PCR擴增。