[發(fā)明專利]高產(chǎn)白藜蘆醇突變體篩選方法的建立

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611069844.7
• 申請(qǐng)日: 2016-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108117588B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊丹丹;梁朝寧;唐雙焱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C07K14/21
• 分類號(hào): C07K14/21;C12N9/00;C12N15/70;C12P7/22;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本發(fā)明涉及白藜蘆醇的生產(chǎn)領(lǐng)域。具體地，涉及用于白藜蘆醇生產(chǎn)的4CL1酶突變體。具體地，例如，該突變體相對(duì)于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突變?yōu)锳sp，第536位氨基酸由Phe突變?yōu)門yr。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及白藜蘆醇的生產(chǎn)。具體地，涉及用于白藜蘆醇生產(chǎn)的4CL1酶突變體，以及篩選該突變體的調(diào)控蛋白TtgR的突變體。

背景技術(shù)

白藜蘆醇最初是發(fā)現(xiàn)于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物。具有抗菌消炎、抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管疾病等多種藥用價(jià)值。目前市場(chǎng)上的白藜蘆醇多通過(guò)從虎杖中通過(guò)化學(xué)提取得到。雖然目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌及酵母中利用來(lái)源于植物的基因合成白藜蘆醇。但現(xiàn)有的白藜蘆醇檢測(cè)手段僅限于高效液相色譜，缺乏可視化、高通量的檢測(cè)篩選方法。無(wú)法方便、快捷地將白藜蘆醇的產(chǎn)量在微生物細(xì)胞的合成中進(jìn)行產(chǎn)量最大化的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過(guò)改造調(diào)控蛋白TtgR，使其能夠響應(yīng)白藜蘆醇的濃度，從而通過(guò)調(diào)節(jié)lacZ基因的表達(dá)，利用藍(lán)白斑的原理，快速高效地篩選出產(chǎn)生白藜蘆醇菌株。該方法節(jié)省時(shí)間，簡(jiǎn)化了篩選步驟。

一方面，本發(fā)明涉及調(diào)控蛋白基因ttgR的突變體，其特征在于編碼序列如SEQ IDNO：9所示，其編碼的氨基酸序列相對(duì)于野生型調(diào)控蛋白TtgR而言，第38位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)榱颂K氨酸，其中所述野生型調(diào)控蛋白TtgR由SEQ ID NO：5編碼。

在另一方面，本發(fā)明涉及4CL1酶的突變體，其特征在于選自由以下各項(xiàng)組成的組：

(1)相對(duì)于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突變?yōu)锳sp，第536位氨基酸由Phe突變?yōu)門yr；

(2)相對(duì)于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突變?yōu)镾er或Thr，第112位氨基酸由Phe突變?yōu)長(zhǎng)eu或Ile，Val，Ala，Gly或Trp；

(3)相對(duì)于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第250位氨基酸由Ile突變?yōu)長(zhǎng)eu，Val，Ala或Gly，第404位氨基酸由Asn突變?yōu)榍衧，Arg，Tyr或Phe，第461位氨基酸由Ile突變?yōu)閂al，Leu，Ala或Gly；

(4)相對(duì)于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第31位氨基酸由Asp突變?yōu)門hr或Ser，第510位氨基酸由Ser突變?yōu)镚ln或Asn；

(5)相對(duì)于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第221位氨基酸由Met突變?yōu)镻he或Tyr；

(6)相對(duì)于氮基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突變?yōu)镾er或Thr，第112位氨基酸由Phe突變?yōu)長(zhǎng)eu，Val，Ala或Gly，第169氨基酸由Glu突變?yōu)锳sp或Glu；第536位氨基酸由Phe突變?yōu)門yr。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及質(zhì)粒，其圖譜如圖1a或圖1b所示。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及上述的調(diào)控蛋白基因ttgR的突變體，其在篩選用于提高白藜蘆醇產(chǎn)量的4CL1酶突變體或篩選產(chǎn)生白藜蘆醇菌株中的應(yīng)用。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其特征在于上

述獲得的所述4CL1酶突變體。