[發(fā)明專利]高產(chǎn)白藜蘆醇突變體篩選方法的建立

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611069844.7
• 申請日: 2016-11-28
• 公開（公告）號: CN108117588B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設計）人: 熊丹丹;梁朝寧;唐雙焱
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K14/21
• 分類號: C07K14/21;C12N9/00;C12N15/70;C12P7/22;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

1.調(diào)控蛋白基因ttgR的突變體，其特征在于編碼序列如SEQ ID NO:9所示，其編碼的氨基酸序列相對于野生型調(diào)控蛋白TtgR而言，第38位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)榱颂K氨酸，其中所述野生型調(diào)控蛋白TtgR由SEQ ID NO:5編碼。

2.4CL1酶的突變體，其特征在于選自由以下各項組成的組：

(1)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突變?yōu)锳sp，第536位氨基酸由Phe突變?yōu)門yr；

(2)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突變?yōu)镾er，第112位氨基酸由Phe突變?yōu)長eu或Trp；

(3)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第250位氨基酸由Ile突變?yōu)長eu，第404位氨基酸由Asn突變?yōu)長ys，第461位氨基酸由Ile突變?yōu)閂al；

(4)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第31位氨基酸由Asp突變?yōu)門hr，第510位氨基酸由Ser突變?yōu)镚ln；

(5)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第221位氨基酸由Met突變?yōu)镻he；

(6)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突變?yōu)镾er，第112位氨基酸由Phe突變?yōu)長eu，第169氨基酸由Glu突變?yōu)锳sp；第536位氨基酸由Phe突變?yōu)門yr；

(7)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第250位氨基酸由Ile突變?yōu)閂al，第404位氨基酸由Asn突變?yōu)門yr，第461位氨基酸由Ile突變?yōu)閂al；

(8)相對于氨基酸序列由SEQ ID NO:27所示的野生型4CL1而言，第250位氨基酸由Ile突變?yōu)閂al，第404位氨基酸由Asn突變?yōu)長ys，第461位氨基酸由Ile突變?yōu)閂al。

3.質(zhì)粒，其選自以下各項：

pTtgR，其序列如SEQ ID NO:6所示；

pTtg，其通過如下方法制備：以DsRed載體為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進行PCR擴增，PCR體系：引物各0.2μM，dNTPs 0.2mM，模板10ng，10×Pyrobest Buffer 5μL，Pyrobest 0.3μL，去離子水將體積補至50μL，PCR反應條件為：94℃30s，50℃30s,72℃1min,以上程序30個循環(huán)，得到的PCR產(chǎn)物用SacII進行酶切后，用T₄ DNA連接酶4℃連接4h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌MC1061，獲得重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒得到pTtg。

4.權(quán)利要求1所述的調(diào)控蛋白基因ttgR的突變體，其在篩選用于提高白藜蘆醇產(chǎn)量的4CL1酶突變體或篩選產(chǎn)生白藜蘆醇菌株中的應用。

5.一種生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其特征在于利用權(quán)利要求2所述的4CL1酶突變體。