[發明專利]一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法有效
| 申請號： | 201611067861.7 | 申請日： | 2016-11-29 |
| 公開（公告）號： | CN106754867B | 公開（公告）日： | 2019-06-28 |
| 發明（設計）人： | 楊天燕;孟瑋;高天翔;劉云國;韓志強;蔡珊珊 | 申請（專利權）人： | 浙江海洋大學 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429 | 代理人： | 李晶晶 |
| 地址： | 316022 浙江省舟*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 重唇魚 線粒體基因組 擴增 基因片段 全序列 線粒體 線粒體全基因組序列 分子水平研究 群體遺傳結構 測序引物 分子標記 基礎資料 技術支持 物種鑒定 序列擴增 序列設計 步移 引物 進化 遺傳 大片 研究 | ||
本發明公開一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法，具體步驟如下：（1）斑重唇魚線粒體Cyt
技術領域
本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法。
背景技術
斑重唇魚Diptychus maculates Steindachner，又名斑黃瓜魚，隸屬于鯉科Cyprinidae，裂腹魚亞科Schizothoracinae，重唇魚屬Diptychus，為冷水雜食性魚類，常棲息于有沙礫的河流及山間支流中。斑重唇魚具有懷卵量少、生殖力較低、生長速度緩慢、性成熟晚等繁殖生物學特性，一旦過度捕撈，資源將難以恢復。近年來由于受到環境變化和人類活動影響，斑重唇魚分布區域正在逐漸縮小，種群數量急劇下降，已被列為新疆維吾爾自治區II級水生野生保護動物。關于斑重唇魚的研究，多集中于繁殖生物學和資源生物學領域，而采用分子生物學技術對斑重唇魚的研究不多，且多集中在線粒體部分序列的比較研究，關于其線粒體基因組全序列擴增的方法未見報道。考慮到目前斑重唇魚遺傳學尤其是線粒體基因組方面的信息量有限，開展其線粒體基因組全序列的研究就顯得十分必要。
目前擴增線粒體基因組全序列的方法大多采用引物步移法，即參考同源序列在保守區設計引物擴增序列并測序，在測出的序列兩端繼續設計引物并擴增測序，如此循環重復，最后將獲得的序列片段進行拼接，獲得線粒體全序列。為保證準確性和可讀性，常規PCR每次擴增序列長度在500-600bp左右，而脊椎動物線粒體基因組多在15kb以上，因此至少需要設計20-30多對引物進行擴增，這種方法不僅費時費力，而且在后期凌亂的序列拼接過程中也容易出現錯誤。而本專利涉及的LA-PCR方法，具有擴增片段長、高保真性等特點，采用該方法對斑重唇線粒體基因組進行擴增國內尚屬首次。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
本發明提供的斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法包括以下步驟：
(1)斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增.
(2)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增。
所述的斑重唇魚線粒體基因組Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增方法，包括以下幾個步驟：
(1)用于擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段引物的篩選，選取了擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因的引物分別為：
Cyt b：上游引物為5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物為5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；
COI：上游引物為5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物為5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；
ND4：上游引物為5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物為5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；
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