[發明專利]一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法

有效

• 申請號: 201611067861.7
• 申請日: 2016-11-29
• 公開（公告）號: CN106754867B
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 楊天燕;孟瑋;高天翔;劉云國;韓志強;蔡珊珊
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 李晶晶

1.斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法，其特征在于，具體步驟如下：

（一）斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增；

（二）斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增；

步驟（一）斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增，具體包括以下幾個步驟：

（1）用于擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段引物的篩選，選取了擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因的引物分別為：

Cyt b：上游引物為5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物為5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；

COI：上游引物為5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物為5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；

ND4：上游引物為5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物為5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；

16S rRNA：上游引物為5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物為5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’；

（2）四個基因片段擴增的PCR反應：反應總體系為50 μL，其中10×buffer 5.0 μL，Mg²⁺終濃度為2.0 mM，2.5 mM 的dNTP4 μL，Taq聚合酶2 units，10 μM的引物各2 μL，斑重唇魚基因組DNA 2 μL，加滅菌水至終體積50 μL；

PCR反應條件為：95℃預變性5 min，然后是35個循環，每個循環包括94℃變性45 s，退火45 s，其中各個 基因片段的退火溫度為：Cyt b和16S rRNA 為57℃、COI為54℃、ND4為56℃，72℃延伸1 min，最后72℃再延伸10 min；

（3）瓊脂糖凝膠電泳檢測：稱量0.7 g瓊脂糖加入70 mL 1×TAE緩沖液的錐形瓶中，微波爐加熱至瓊脂粉完全溶解且無泡沫，冷卻至50-60℃加入7 μL核酸染料Gelview，輕輕搖勻避免產生氣泡；待冷卻至不燙手時將膠緩緩倒入膠槽內，待瓊脂糖凝膠完全凝固后豎直拔掉梳子，將2 μL斑重唇魚DNA樣本與0.5 μL 6×DNA loading buffer混合后依次上樣，最后點上6μL DL2000 Marker后開始電泳；電泳電壓設定為120V，電流400mA，時間30 min；電泳完畢在凝膠成像系統照相，通過調節光圈和曝光時間，選擇合適的濾光片，得到成像清晰、背景較低的照片；

步驟（二）所述的斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增，包括以下幾個步驟：

（1）斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增引物的設計：以獲得的Cyt b、COI、ND4和16SrRNA四個基因序列片段為模板，在其兩端分別設計4對LA-PCR引物，用于擴增斑重唇魚線粒體基因組剩余部分序列；

以16S rRNA基因片段為起點、COI基因片段為終點的環形區域設計第一對引物P1，上游引物為5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物為5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；

以COI基因片段為起點、ND4基因片段為終點的環形區域設計第二對引物P2，上游引物為5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物為5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；

以ND4基因片段為起點、Cyt b基因片段為終點的環形區域設計第三對引物P3，上游引物為5’-CGCTGCGGTATGGTGATTCGT-3’，下游引物為5’- ATGATGCTCCGTTGGCGTGTA-3’；

以Cyt b基因片段為起點、16S rRNA基因片段為終點的環形區域設計第四對引物P4，上游引物為5’-TGACCTACCAGCACCATCCAACAT-3’，下游引物為5’-GACAGTTAAGCCCTCGTTTAGCCA-3’；

（2）根據設計的4對LA-PCR引物擴增斑重唇魚線粒體基因組全序列，使用LA Taq聚合酶；

LA-PCR反應：反應總體系為50μL，其中10×LA PCR buffer II 5.0 μL，Mg²⁺終濃度為2.0 mM，2.5 mM 的dNTP8 μL，LA Taq聚合酶2 units，20 μM的引物各1 μL，50 ng/μL的斑重唇魚基因組DNA 2.5 ng，加滅菌水至終體積50 μL；

LA-PCR反應條件為：95℃預變性2 min，然后是30個循環，每個循環包括94℃變性30 s，退火30 s ，其中各個引物的退火溫度為：P1為57℃、P2為60℃、P3為58℃、P4為59℃，P1-P472℃延伸的時間分別為4、6、3、5min，最后72℃再延伸10 min；

4對LA-PCR引物擴增分別獲得目的序列片段長度分別為4kb、6kb、3.1kb和4.5kb；

（3）采用引物步移法，分別以擴增的4個大片段序列為模板，每隔500 bp，設計一條測序引物對其進行分段擴增，28條測序引物序列信息如下：

以16S rRNA基因片段為起點、COI基因片段為終點的環形區域6條測序引物為：

5’-TCAACGAACCAAGTTACCCT-3’

5’-TACGGGCTTCTACAACCTAT-3’

5’-GCCCCTTCGCACTATTTTTC-3’

5’-GGAACCACTTTGACTTTTGC-3’

5’-CCACCTTACACTGCTTGCCC-3’

5’-GTGAAAATCTTCTAGCCCCT-3’

以COI基因片段為起點、ND4基因片段為終點的環形區域10條測序引物為：

5’-CGGCAAAAAAGAACCATTCG-3’

5’-GCCTATGCCCTATGAAACAC-3’

5’-GTGAACTATTTTACCAGCCG-3’

5’-AAAGATTGGTGCCTCCCGAC-3’

5’-CCGTGATTATTGGAATGCGA-3’

5’-CGTGACATTATCCGAGAAGG-3’

5’-CCACTTTACATCTGACCACC-3’

5’-AGGGAGTTAGTCCAAAGCAA-3’

5’-CACCCCTCTTTTAGTGCTCT-3’

5’-TAGCAGCGGTCCTACTAAAG-3’

以ND4基因片段為起點、Cyt b基因片段為終點的環形區域5條測序引物為：

5’-CACCTCCCTCCTCGTAGTTT-3’

5’-TCGGGTAGGGGACATTGGAT-3’

5’-GTAAGATGGGAGGCTTGTTT-3’

5’-GGCTTCTTTCCCTCAACTAT-3’

5’-GCAAAGACTACCAACATTCC-3’

以Cyt b基因片段為起點、16S rRNA基因片段為終點的環形區域7條測序引物為：

5’-TTGGATTGAACTCGGACGCA-3’

5’-AAGCATCGGTCTTGTAATCC-3’

5’-CCAAAGCCAGGATTCTGAAC-3’

5’-GGCTCAAATACTGACTAAGG-3’

5’-GCTCTAACCCGACTTACACA-3’

5’-CCCGTCTAACCTCACCACTT-3’

5’-GTATGGGAGACAGAAAAGGT-3’。