[發明專利]農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷莖段轉化系統

有效

• 申請號: 201611064062.4
• 申請日: 2016-11-28
• 公開（公告）號: CN106755063B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 趙忠娟;魏艷麗;李紀順;楊合同;王貽蓮
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生態研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

本發明公開了農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷莖段轉化系統。本發明涉及一種利用農桿菌轉化耐鹽椒樣薄荷莖段獲得轉基因植株的方法，所述方法包括以下步驟：(1)椒樣薄荷莖段預培養，(2)農桿菌介導的外源基因轉化，(3)共培養，(4)叢生芽再生與抗生素篩選，(5)生根誘導和陽性植株檢測。本發明是一種可以運用于椒樣薄荷基因轉化的體系，適用于多種植物表達載體的轉化，容易獲得再生植株。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，特別是涉及農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷莖段轉化系統。

背景技術

椒樣薄荷(Mentha piperita L.)是唇形科薄荷屬多年生草本植物，別名歐洲薄荷、胡椒薄荷、黑薄荷，系水薄荷(Mentha aquatica)和綠薄荷(Mentha spicata)雜交而成的六倍體不育系，至今已有250年。原產于歐洲，我國20世紀開始引進，目前在新疆和陜西有小規模種植。椒樣薄荷作為廣泛種植的精油作物之一，薄荷精油為其最主要產品，主要含薄荷酮、薄荷醇、乙酸薄荷酯等118種成分，香氣純正，清爽宜人，廣泛用于日用化妝品、醫藥和食品行業。

山東省應用微生物重點實驗室篩選出1種可在黃河三角洲地區大規模推廣種植耐鹽椒樣薄荷，并經過品種審定命名為“科院1號”。該耐鹽椒樣薄荷能夠耐受0.8％NaCl脅迫，并具有很好的脫鹽效果。

農桿菌(Agrobacterium)是一類生活在植物根的表面，依靠根組織滲透出來的營養物質生存的，普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌。農桿菌具有天然感染植物細胞的能力，可以誘發植物冠癭瘤。農桿菌中存在一種巨大質粒，稱為Ti質粒。Ti質粒可以作為外源基因的載體，介導外源基因的轉化。目前農桿菌介導的遺傳轉化已經廣泛應用于雙子葉植物和單子葉植物中，應用的農桿菌主要為根癌農桿菌和發根農桿菌兩種。

農桿菌轉化的方法主要有整體植株接種共感染法和葉盤轉化法。葉盤轉化法是由Horsch等發展起來的一種轉化方法，其操作方法是首先用打孔器從消毒葉片上取得葉圓片，亦稱之葉盤。后來這一共培養系統被廣泛用于愈傷組織、細胞、懸浮培養細胞、莖切段、子葉切片、下胚軸切段等離體材料的轉化。目前，椒樣薄荷的農桿菌轉化多采用的是葉盤法，外植體主要為葉片。本研究室對獲得的耐鹽椒樣薄荷的體外再生體系進行研究發現，以葉片作為外植體建立再生體系比較困難，葉片容易褐化且分化效率較低。

發明內容

本發明就是針對上述存在的缺陷而提供農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷莖段轉化系統，具體為種使用耐鹽椒樣薄荷含芽莖段為外植體的外源基因轉化方法。相較于葉片含有腋芽的莖段分化和獲得再生植株都較容易，可以用來作為農桿菌介導轉化的外植體。

本發明的農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷莖段轉化系統技術方案為，步驟包括：

(1)耐鹽椒樣薄荷莖段預培養；

(2)農桿菌介導的外源基因轉化；

(3)共培養；

(4)叢生芽再生與抗生素篩選；

(5)生根誘導和陽性植株檢測。

步驟(1)所用耐鹽椒樣薄荷莖段為含腋芽莖段，并用無菌刀片在腋芽處輕輕劃幾刀，使其具有損傷易于轉化和叢生芽分化，然后將莖段放入預培養的培養基中黑暗條件下預培養3天。

預培養所用培養基為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

步驟(2)農桿菌介導的外源基因轉化的方法是：將預培養的耐鹽椒樣薄荷莖段置于用轉化液重懸的農桿菌菌液中，菌液調整OD₆₀₀為0.6-0.8，抽真空10-15min，然后黑暗條件下30℃，200r/min震蕩培養30min。