[發(fā)明專利]一種基于定性濾紙的三維肝模型的藥物肝毒性評(píng)價(jià)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611063241.6
• 申請(qǐng)日: 2016-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108118079B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦建華;王亞清;王麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽(yáng)晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發(fā)明提供了一種基于定性濾紙的三維肝模型的藥物肝毒性評(píng)價(jià)方法，具體為：將定性濾紙作為細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料，將濾紙放置24孔板中使濾紙懸浮在培養(yǎng)液中，可進(jìn)行充分的物質(zhì)傳輸和營(yíng)養(yǎng)成分的交換，從而使細(xì)胞在濾紙上進(jìn)行三維生長(zhǎng)，所述基于濾紙的肝模型即在定性濾紙上進(jìn)行hiHep細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了一種可體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并維持肝特異性功能的三維肝組織，利用它可以在體外進(jìn)行高通量的肝毒性藥物測(cè)試及評(píng)估，本發(fā)明所建立的模型可以用于藥物篩選、毒性檢測(cè)以及疾病研究中，為肝病研究領(lǐng)域的新藥開(kāi)發(fā)和篩選提供了重要平臺(tái)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬組織工程及藥物研究領(lǐng)域，具體涉及一種基于定性濾紙的三維肝模型的藥物肝毒性評(píng)價(jià)。

背景技術(shù)

藥物誘導(dǎo)的肝損傷(DILI)一直是導(dǎo)致急性肝功能衰竭的重要原因，嚴(yán)重威脅著人類健康。研究表明，引起DILI的不同的風(fēng)險(xiǎn)因素包括遺傳易感性因素，非基因因素(年齡、性別和疾病)和藥物因素(每天劑量、代謝特征和藥物相互作用)。目前各種肝臟疾病的研究以及藥物篩選、毒性檢測(cè)方面大多還是依賴于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。然而由于人和其他動(dòng)物之間肝臟功能的差異性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果難以完全轉(zhuǎn)化到臨床中，臨床前藥物肝毒性預(yù)測(cè)和新藥開(kāi)發(fā)受到嚴(yán)重制約。

目前，用于藥物毒性評(píng)價(jià)的體外肝模型的組織或細(xì)胞包括肝微粒體，肝癌細(xì)胞系或其他肝細(xì)胞系等，然而它們都缺乏許多重要的肝細(xì)胞特異性功能，不能有效地用于體外藥物肝毒性檢測(cè)。原代肝細(xì)胞或肝切片擁有正常的肝臟結(jié)構(gòu)和功能，但在體外培養(yǎng)環(huán)境下會(huì)很容易喪失表型和正常的肝功能，因此不適用于體外長(zhǎng)期的藥物毒性檢測(cè)。hiHep細(xì)胞作為一種由成纖維細(xì)胞直接誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化而來(lái)的肝細(xì)胞，具有較為完整的正常肝功能，CYP450代謝酶和其他重要肝藥酶的表達(dá)水平較好，并且在使用過(guò)程中不涉及倫理問(wèn)題。目前，尚未有報(bào)道利用該細(xì)胞進(jìn)行體外三維肝模型構(gòu)建及高通量的藥物毒性評(píng)價(jià)。

在體外構(gòu)建功能性的肝組織過(guò)程中，模擬體內(nèi)肝細(xì)胞復(fù)雜微環(huán)境并實(shí)現(xiàn)體外肝細(xì)胞的三維培養(yǎng)，對(duì)維持肝細(xì)胞的分化表型和改善肝細(xì)胞功能尤為重要。然而目前許多三維肝模型或肝反應(yīng)器擁有許多的局限性，如肝細(xì)胞種類和來(lái)源有限，生物材料的性能及安全性差，體外細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境難以長(zhǎng)期維持，培養(yǎng)體系復(fù)雜難以擴(kuò)大等。濾紙作為一種商業(yè)化、低成本、生物兼容性好，以及其本身獨(dú)特的多孔三維結(jié)構(gòu)，非常適合作為細(xì)胞三維培養(yǎng)的支架材料。目前尚未有報(bào)道利用濾紙材料進(jìn)行肝細(xì)胞的培養(yǎng)，并構(gòu)建可進(jìn)行體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的三維肝組織模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于定性濾紙的三維肝模型的藥物肝毒性評(píng)價(jià)方法，具體為：一種可用于進(jìn)行藥物肝毒性評(píng)價(jià)的一種基于定性濾紙的三維肝模型陣列，該模型可在體外長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，并用于對(duì)乙酰氨基酚和吡格列酮兩種臨床口服藥的短期和長(zhǎng)期誘導(dǎo)肝毒性的檢測(cè)和評(píng)估。

一種基于定性濾紙的三維肝模型的藥物肝毒性評(píng)價(jià)方法，具體步驟為：

(1)定性濾紙的三維肝模型的建立：將濾紙置于細(xì)胞培養(yǎng)24孔板中，在其上包被一層100ug/ml濃度的I型鼠尾膠原，然后在其上面先后種上hiHep肝細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)10天后，得到具有肝特異性功能的三維肝模型，

(2)藥物肝毒性評(píng)價(jià)：在上述模型分別加入兩種臨床口服藥對(duì)進(jìn)行不同藥物濃度和時(shí)間點(diǎn)的處理，檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞分泌的LDH水平，用于藥物引起的肝毒性(急/慢性)評(píng)估，并與二維培養(yǎng)的hiHep肝細(xì)胞的藥物肝毒性檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比。

該定性濾紙的三維肝模型用于研究形成的三維組織表型特征，以掃描電鏡和蘇木素-伊紅染色方法觀察組織三維形態(tài)。

所述肝模型形成的三維組織表型特征，分別以掃描電鏡和蘇木素‐伊紅染色方法觀察組織的三維形態(tài)，具體為：取在濾紙上培養(yǎng)第14天的肝組織(hiHep細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng))進(jìn)行電鏡掃描，觀察三維組織結(jié)構(gòu)形成；分別取在濾紙上培養(yǎng)7天的肝組織(hiHep細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng))和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行蘇木素‐伊紅染色，觀察肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案為：