[發(fā)明專利]高通量微陣列芯片在干細胞類心肌組織誘導分化中的應用

在審

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• 申請日: 2016-11-26
• 公開（公告）號: CN108117987A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 秦建華;王麗;陶婷婷
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12N5/077;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發(fā)明提供一種高通量微陣列芯片在干細胞類心肌組織誘導分化中的應用，該應用為在陣列微柱結構的PDMS聚合物芯片上形成高通量的人誘導性多潛能干細胞的3D擬胚體結構并原位進行類心肌組織的誘導分化。該方法可以高通量形成大小均一的類心臟微組織，并可以原位動態(tài)觀察類心臟微組織的生長、發(fā)育的全過程。該方法克服了傳統(tǒng)擬胚體形成和3D心肌誘導分化分步實現(xiàn)的缺點，具有簡化實驗操作步驟，高通量、原位動態(tài)觀察心肌發(fā)育的優(yōu)勢，無需特殊的儀器和試劑，可與其他技術集成化。主要用于人心臟發(fā)育學、疾病模型構建、心臟藥物及毒物評估等領域。

技術領域

本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及一種高通量微陣列芯片在干細胞類心肌組織誘導分化中的應用。

背景技術

心臟是人體重要的臟器之一，先天性心臟病以及成人心臟病嚴重威脅人類健康和生命。利用人源性的心肌細胞和類心肌組織來研究心臟發(fā)育學、疾病機制、藥物評價及毒性實驗具有重要的科學意義。人誘導性多潛能干細胞和胚胎干細胞具有自我更新和多向分化的能力，利用3維擬胚體結構進行心肌組織的發(fā)育學研究及疾病模型構建具有重要的應用價值。傳統(tǒng)方法是利用懸滴法、商品化的小坑結構先形成擬胚體，再將擬胚體轉移到低粘附的培養(yǎng)皿中，進一步進行心肌細胞誘導分化。在轉移過程中，擬胚體容易收到較大流體的剪切力刺激，干擾細胞的活性和分化的效果。傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿需要大量的培養(yǎng)基，費用較為昂貴，在換液過程中也會丟失部分擬胚體造成細胞浪費。此外由于心肌細胞的跳動特性，無法定位觀察心肌組織的發(fā)育和藥物反應。

制備高通量陣列微柱結構的芯片的材料為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微加工和微流控領域用的最多的材料，具有透明、透氣、惰性好、疏水性、易成型、細胞相容性佳等優(yōu)勢。目前文獻報道的利用芯片進行心肌誘導分化的方法都是基于聚合物凝膠材料的小坑法形成擬胚體，再將擬胚體轉移到新的低黏附培養(yǎng)系統(tǒng)，步驟繁瑣；轉移過程中對干細胞會造成一定程度的損傷，細胞碎屑不容易清除等缺點。低粘附懸浮培養(yǎng)心肌微組織，不能實時定位觀察同一個擬胚體來源的類心肌微組織的發(fā)育分化過程。

目前利用微流控芯片制備的微柱結構中，主要以微小尺度為主，用于研究表面拓撲結構對單細胞行為學的影響，尚無利用較大微柱形成微培養(yǎng)空間進行擬胚體形成和原位發(fā)育研究的應用。

因此，本發(fā)明主要針對上述人干細胞源3維類心肌組織分化的局限性，制備一種高通量微陣列芯片用于人誘導性多潛能干細胞的類心肌微組織分化，用于干細胞領域的應用研究。

發(fā)明內容

針對上述問題，本發(fā)明的目的是制備一種高通量微陣列芯片用于干細胞類心肌組織誘導分化。

一種高通量微陣列芯片的制備方法，具體步驟如下：

(1)利用軟蝕刻技術制備高通量凹陷小坑的SU-8模板，對模板進行低黏附修飾，確保SU-8與PDMS聚合物容易剝離；

(2)制作高通量陣列微柱結構的PDMS聚合物芯片：將PDMS與引發(fā)劑按照體積比10～14：1混合，澆注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加熱固化1～2h，常溫剝離SU-8模板，得到高通量的固定間距的陣列微柱結構PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周邊用PDMS模塊圍起形成局限的開放培養(yǎng)池，放于80℃烘箱內加熱40～60分鐘，得到微陣列芯片。

SU-8模板低黏附修飾具體為：采用低粘附試劑硅烷化處理10-15分鐘，80℃烘烤1～2小時，自然降溫。

模板凹陷小坑的深度為500-1000微米，間距為30-100微米，微柱間距相同；其中微柱尺寸和微柱間距不限于該范圍。

微柱尺寸為直徑500-1000微米，高度為500～1000微米，間距為30-100微米，微柱間距相同。

所述模板低粘附處理試劑為三甲基氯硅烷或者氟硅烷等；