[發(fā)明專利]高通量微陣列芯片在干細(xì)胞類心肌組織誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201611057501.9
• 申請日: 2016-11-26
• 公開（公告）號: CN108117987A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦建華;王麗;陶婷婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12N5/077;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種高通量微陣列芯片的制備方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)利用軟蝕刻技術(shù)制備高通量凹陷小坑的SU-8模板，對模板進(jìn)行低黏附修飾，確保SU-8與PDMS聚合物容易剝離；

(2)制作高通量陣列微柱結(jié)構(gòu)的PDMS聚合物芯片：將PDMS與引發(fā)劑按照體積比10～14：1混合，澆注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加熱固化1～2h，常溫剝離SU-8模板，得到高通量的固定間距的陣列微柱結(jié)構(gòu)PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周邊用PDMS模塊圍起形成局限的開放培養(yǎng)池，放于80℃烘箱內(nèi)加熱40～60分鐘，得到微陣列芯片。

2.按照權(quán)利要求1所述的微陣列芯片的制備方法，其特征在于：SU-8模板低黏附修飾具體為：采用硅烷化處理10-15分鐘，80℃烘烤1～2小時，自然降溫。

3.按照權(quán)利要求1所述的微陣列芯片的制備方法，其特征在于：模板凹陷小坑的深度為500-1000微米，間距為30-100微米，微柱間距相同；其中微柱尺寸和微柱間距不限于該范圍。

4.按照權(quán)利要求1所述的微陣列芯片的制備方法，其特征在于：微柱尺寸為直徑500-1000微米，高度為500-1000微米，間距為30-100微米，微柱間距相同。

5.按照權(quán)利要求1所述的微陣列芯片的制備方法，其特征在于芯片形狀為圓形或者方形。

6.一種高通量微陣列芯片在干細(xì)胞類心肌組織誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用，其特征在于：利用上述芯片高通量形成擬胚體并進(jìn)行原位干細(xì)胞來源的類心肌組織誘導(dǎo)分化，具體步驟為：

(1)芯片無菌化：將上述微陣列芯片用氧等離子處理1～3分鐘，加入去離子水；120～125℃高壓滅菌20～30分鐘；將芯片置于無菌的培養(yǎng)皿中4℃保存或降至室溫后使用。

(2)芯片低粘附處理：利用低粘附試劑處理4～24小時，去除試劑用PBS清洗5～10次；

(3)擬胚體形成：取出芯片，加入mTeSR1培養(yǎng)基，不斷用移液器吹打，去除小柱間的氣泡，使微柱間隙充滿培養(yǎng)基；將人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(hiPSCs)用分散酶消化成單細(xì)胞，將密度在5×10⁶-10×10⁶個hiPSCs/cm²細(xì)胞接種到(2)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培養(yǎng)基，并加入10～20μM的Y27632。靜止培養(yǎng)24～48小時；根據(jù)細(xì)胞接種數(shù)量實現(xiàn)擬胚體大小的控制，(5-10)x10⁶/cm²范圍的細(xì)胞密度可以實現(xiàn)150-300微米直徑的細(xì)胞球；

(3)類心肌組織誘導(dǎo)分化：擬胚體形成后，加入2ml誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1640/B27-insulin，添加終濃度在6～12μM的CHIR99021作用24～30小時；以加入CHIR99021作為誘導(dǎo)分化第1天，第2、3天分加入2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基1640/B27-insuline，第4、5天分別加入2ml誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1640/B27-insulin，添加終濃度6～12μM的IWP2；第7天以后加入2ml心肌細(xì)胞培養(yǎng)基1640/B27，每隔1天更換新鮮心肌細(xì)胞培養(yǎng)基；

(4)不同形狀類心肌微組織形成：通過增加細(xì)胞密度，形成不同形狀、尺寸的三維類心肌微組織，原位觀察微組織的生長、發(fā)育；

(5)所形成的類心肌微組織可以用于切片，組織染色。

7.按照權(quán)利要求6所述一種高通量微陣列芯片在干細(xì)胞類心肌組織誘導(dǎo)分化的應(yīng)用，其特征在于：所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1640/B27-insulin基礎(chǔ)成分為RPMI1640，另外添加占總體積2％的B27-insulin,占總體積1％penicillin-streptomycin(100×)，終濃度10ug/ml抗支原體藥物，終濃度10ug/ml Gentamicin,終濃度0.25ug/ml Amphotericin B。