[發(fā)明專利]微陣列芯片的制備方法及其在干細(xì)胞類腦發(fā)育中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611057478.3
• 申請(qǐng)日: 2016-11-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108117985A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦建華;王麗;朱玉娟;陶婷婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C12M3/00
• 分類號(hào): C12M3/00;C12N5/079;C12N5/0793
• 代理公司: 沈陽(yáng)晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發(fā)明提供一種微陣列芯片的制備方法及其在干細(xì)胞類腦發(fā)育中的應(yīng)用，利用芯片上的陣列微柱結(jié)構(gòu)圍成的有限空間形成高通量的人干細(xì)胞的3D類腦組織。該方法可以高通量形成大小均一的類腦組織，并可以原位動(dòng)態(tài)觀察腦微組織的生長(zhǎng)、發(fā)育全過(guò)程。腦組織可以進(jìn)一步切片染色，評(píng)估微觀細(xì)胞尺度的變化。具有簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，高通量、原位動(dòng)態(tài)觀察人腦發(fā)育的優(yōu)勢(shì)，無(wú)需特殊的儀器和試劑，可與其他技術(shù)集成化。主要用于人腦發(fā)育學(xué)、腦神經(jīng)疾病模型構(gòu)建、神經(jīng)系統(tǒng)藥物及毒物評(píng)估等領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微陣列芯片的制備方法及其在干細(xì)胞類腦發(fā)育中的應(yīng)用。。

背景技術(shù)

大腦是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要部位，是人體重要的臟器之一，多種腦疾病嚴(yán)重影響了人類的健康和生命質(zhì)量。腦組織的生理復(fù)雜程度已經(jīng)超出了現(xiàn)有手段的能力。研究人腦的結(jié)構(gòu)、發(fā)育特點(diǎn)，構(gòu)建疾病模型，需要新的技術(shù)手段。人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞來(lái)源的類腦組織形成為腦組織的發(fā)育學(xué)研究，腦疾病機(jī)制研究提供了重要的細(xì)胞來(lái)源。傳統(tǒng)腦組織形成方法主要是利用三維(3D)懸滴法形成擬胚體再進(jìn)一步誘導(dǎo)分化，存在組織結(jié)構(gòu)大小不可控，擬胚體形成與腦發(fā)育分化分步實(shí)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)的腦組織無(wú)法定位觀察，操作步驟繁瑣等缺點(diǎn)。

微流控芯片技術(shù)為三維細(xì)胞培養(yǎng)提供了可控的微結(jié)構(gòu)，芯片多以生物相容性的PDMS聚合物為材料，具有透明、透氣、惰性好、疏水性、易成型、細(xì)胞相容性佳等優(yōu)勢(shì)。PDMS的細(xì)胞低粘附特性，可以促使擬胚體形成和腦發(fā)育研究在一張芯片上，避免轉(zhuǎn)移步驟，減少組織的丟失浪費(fèi)，其微尺度空間有利于細(xì)胞內(nèi)分泌和旁分泌因子的相互作用。目前利用微流控芯片形成擬胚體結(jié)構(gòu)多以小坑為主，誘導(dǎo)分化需要轉(zhuǎn)移組織到新的低粘附培養(yǎng)皿中，主要原因是小坑結(jié)構(gòu)限制了組織的生長(zhǎng)，細(xì)胞碎片難以去除。因此本發(fā)明采用微柱結(jié)構(gòu)圍成開(kāi)放的組織培養(yǎng)區(qū)域，通過(guò)控制空間大小，給予組織足夠的生長(zhǎng)空間。有別于其他微柱結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，主要利用大尺度的微柱結(jié)構(gòu)調(diào)控組織培養(yǎng)區(qū)域。

因此，本發(fā)明主要針對(duì)上述人干細(xì)胞源3D類腦發(fā)育的局限性，制備一種高通量微陣列芯片用于人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的類腦組織分化，用于干細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的提供一種微陣列芯片的制備方法及其在干細(xì)胞類腦發(fā)育中的應(yīng)用。

一種微陣列芯片的制備方法，具體步驟如下：

(1)利用軟蝕刻技術(shù)制備高通量凹陷小坑的SU-8模板，對(duì)模板進(jìn)行低黏附修飾，確保SU-8與PDMS聚合物容易剝離；

(2)制作高通量陣列微柱結(jié)構(gòu)的PDMS聚合物芯片：將PDMS與引發(fā)劑按照體積比10～14：1混合，澆注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加熱固化1～2h，常溫剝離SU-8模板，得到高通量的固定間距的陣列微柱結(jié)構(gòu)PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周邊用PDMS模塊圍起形成局限的開(kāi)放培養(yǎng)池，放于80℃烘箱內(nèi)加熱40～60分鐘，得到所制備的擬胚體原位形成與分化的微陣列芯片。

SU-8模板低黏附修飾具體為：采用低粘附處理試劑硅烷化處理10-15分鐘，80℃烘烤1～2小時(shí)，自然降溫。

所述低粘附處理試劑為三甲基氯硅烷或者氟硅烷。

模板凹陷小坑的深度為500-1000微米，間距為30-100微米，微柱間距相同；其中微柱尺寸和微柱間距不限于該范圍。

所述陣列微柱結(jié)構(gòu)的微柱結(jié)構(gòu)頂端為凸起的曲面結(jié)構(gòu)；微柱尺寸為直徑500-1000微米，高度為500～1000微米，間距為50-100微米，微柱間距相同。

所述引發(fā)劑為：184silicone elastomer curing agent.