[發明專利]微陣列芯片的制備方法及其在干細胞類腦發育中的應用

在審

• 申請號: 201611057478.3
• 申請日: 2016-11-26
• 公開（公告）號: CN108117985A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 秦建華;王麗;朱玉娟;陶婷婷
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12N5/079;C12N5/0793
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種微陣列芯片的制備方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)利用軟蝕刻技術制備高通量凹陷小坑的SU-8模板，對模板進行低黏附修飾，確保SU-8與PDMS聚合物容易剝離；

(2)制作高通量陣列微柱結構的PDMS聚合物芯片：將PDMS與引發劑按照體積比10～14：1混合，澆注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加熱固化1～2h，常溫剝離SU-8模板，得到高通量的固定間距的陣列微柱結構PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周邊用PDMS模塊圍起形成局限的開放培養池，放于80℃烘箱內加熱40～60分鐘，得到微陣列芯片。

2.按照權利要求1所述的微陣列芯片的制備方法，其特征在于：SU-8模板低黏附修飾具體為：采用硅烷化處理10-15分鐘，80℃烘烤1～2小時，自然降溫。

3.按照權利要求1所述的微陣列芯片的制備方法，其特征在于：模板凹陷小坑的深度為500-1000微米，間距為30-100微米，微柱間距相同；其中微柱尺寸和微柱間距不限于該范圍。

4.一種微陣列芯片在干細胞類腦發育中的應用，其特征在于：利用上述芯片高通量形成擬胚體并進行原位干細胞來源的類腦組織發育，具體步驟為：

(1)芯片無菌化：將上述微陣列芯片用氧等離子處理1～3分鐘，加入去離子水；120～125℃高壓滅菌20～30分鐘；將芯片置于無菌的培養皿中4℃保存或降至室溫后使用；

(2)芯片低粘附處理：利用低粘附試劑處理4～24小時，去除試劑用PBS清洗5～10次；

(3)擬胚體形成：在(2)中的芯片，加入mTeSR1培養基，不斷用移液器吹打，去除小柱間的氣泡，使微柱間隙充滿培養基；將人誘導性多潛能干細胞(hiPSCs)用分散酶消化成單細胞，將密度在6×10⁶-10×10⁶個hiPSCs/cm²細胞接種到(2)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培養基，并加入20-50μM的Y27632；靜止培養24～48小時；根據細胞接種數量實現擬胚體大小的控制，(6-10)x10⁶/cm²范圍的細胞密度可以實現200-300微米直徑的細胞球；

(4)第2-6天加入新鮮mTeSR1，去除Y27632，常規培養，每2天換液；

(5)第一階段誘導分化：去除mTeSR1,加入2ml第一階段誘導培養基，靜止培養5-6天；每2天換液；

(6)皮層發育誘導：將載有芯片的培養皿至于冰上，去除培養基，加入1～2ml融解的Matrigel，覆蓋在組織上面，37℃固化20分鐘，加入2ml第二階段誘導培養基；該階段靜止培養30天以上；

(7)大腦發育后用刀片切取組織，進行腦組織切片染色。具體步驟為：將組織用固定液固定6-12小時，PBS清洗，用質量比為25％蔗糖脫水，用OCT包埋，-80°固化，用冰凍切片機制備5-10微米厚度的組織切片；免疫熒光染色，鑒定腦組織的特定細胞

(8)發育的腦組織進行神經元分化，類腦組織手動切成微小組織，黏附在組織培養皿中，誘導神經元成熟分化。

5.按照權利要求4所述的一種微陣列芯片在干細胞類腦發育中的應用，其特征在于：所述第一階段誘導培養基基礎成分為DMEM/F12，加入占總體積0.8～1％的N2,占總體積0.8～1％的GlutaMAX，占總體積0.8～1％的MEM-NEAA,終濃度為1～2ug/ml的heparin；占總體積1％penicillin-streptomycin(100×)，終濃度10ug/ml抗支原體藥物，終濃度10ug/mlGentamicin,終濃度0.25ug/ml Amphotericin B。