[發(fā)明專(zhuān)利]蘋(píng)果酸酶重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611046752.7
• 申請(qǐng)日: 2016-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106591342B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉立明;高聰;陳修來(lái);胡貴鵬;郭亮;劉佳;羅秋玲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 姚惠菱

本發(fā)明涉及一種蘋(píng)果酸酶重組菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：對(duì)NADP依賴型蘋(píng)果酸酶基因進(jìn)行突變，得到蘋(píng)果酸酶突變基因；將蘋(píng)果酸酶突變基因與載體連接，然后在宿主菌中重組表達(dá)，得到蘋(píng)果酸酶重組菌；本發(fā)明同時(shí)還請(qǐng)求保護(hù)采用上述方法構(gòu)建的蘋(píng)果酸酶重組菌以及一種生產(chǎn)L?蘋(píng)果酸的方法，包括以下步驟：將上述蘋(píng)果酸酶重組菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行好氧發(fā)酵；當(dāng)蘋(píng)果酸酶重組菌生長(zhǎng)至OD₆₀₀為0.4?0.8時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)，然后再進(jìn)行微好氧發(fā)酵。本發(fā)明所獲得的蘋(píng)果酸酶重組菌具有較高的催化丙酮酸羧化反應(yīng)的能力，可顯著提高菌體生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蘋(píng)果酸酶重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蘋(píng)果酸，學(xué)名為2-羥基丁二酸，作為一種重要的C4二羧酸，蘋(píng)果酸應(yīng)用廣泛。蘋(píng)果酸在食品領(lǐng)域是繼乳酸、檸檬酸之后的第三大食品酸味劑；在醫(yī)藥領(lǐng)域，其具有抗疲勞，保護(hù)肝、腎、心臟的作用；在化工領(lǐng)域，L-蘋(píng)果酸是化妝品添加劑，是印染工業(yè)的保色劑和增效劑，是牙膏和煙草產(chǎn)品的調(diào)味劑、清潔劑和除臭劑，也是焊錫助劑、廢棄脫硫劑和電鍍合劑等。

L-蘋(píng)果酸的生物合成代謝路徑中存在5條微生物參與途徑。路徑I：以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)為代謝起點(diǎn)，利用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP carboxylase)或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP Kinase)將PEP羧化成草酰乙酸，草酰乙酸進(jìn)一步在蘋(píng)果酸脫氫酶作用下還原生成L-蘋(píng)果酸，該過(guò)程伴隨一分子CO₂固定，其最大理論得率為2mol·mol^-1葡萄糖；路徑II：以丙酮酸為代謝起點(diǎn)，利用丙酮酸羧化酶將丙酮酸羧化為草酰乙酸，再經(jīng)蘋(píng)果酸脫氫酶作用還原成L-蘋(píng)果酸，過(guò)程中伴隨著一分子CO₂的固定，其最大理論得率為2mol·mol^-1葡萄糖；路徑III：以丙酮酸為代謝起點(diǎn)，由蘋(píng)果酸酶介導(dǎo)參與實(shí)現(xiàn)丙酮酸向L-蘋(píng)果酸一步轉(zhuǎn)化，過(guò)程中伴隨著CO₂分子的固定，最大理論得率為2mol·mol^-1葡萄糖；路徑IV：以草酰乙酸和乙酰輔酶A為代謝起點(diǎn)，通過(guò)合成檸檬酸后進(jìn)入TCA循環(huán)氧化為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸，其最大理論得率為1mol·mol^-1葡萄糖；路徑V：以異檸檬酸為起點(diǎn)，經(jīng)乙醛酸循環(huán)合成L-蘋(píng)果酸，其最大理論得率為1.33mol·mol^-1葡萄糖。與路徑I和路徑II相比，路徑III沒(méi)有中間產(chǎn)物草酰乙酸的合成，較短的路徑可以減少碳流損耗；與路徑IV和路徑V相比，路徑III不僅具有更高的最大理論得率而且還伴隨著一分子CO₂的固定，高效利用原料的同時(shí)減少了環(huán)境中的溫室氣體，具有更加經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)；此外，路徑III在合成L-蘋(píng)果酸的過(guò)程中，只涉及一種輔因子(NADPH/NADH)的參與，較需要多種輔因子參與其他路徑更方便調(diào)控。

動(dòng)力學(xué)研究表明，在生理?xiàng)l件下，蘋(píng)果酸酶主要催化蘋(píng)果酸到丙酮酸的脫羧反應(yīng)，但是該酶熱力學(xué)上羧化反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)自由能為-2kcal/mol，熱力學(xué)上可行。且已有的研究已經(jīng)證實(shí)了蘋(píng)果酸酶在催化丙酮酸羧化生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的可能性。例如，Ohno等利用來(lái)自缺陷假單胞菌psedomonas diminuta的蘋(píng)果酸酶轉(zhuǎn)化丙酮酸生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸進(jìn)行CO₂的固定，通過(guò)添加葡萄糖-6-磷酸脫氫酶耦合NADH再生，經(jīng)過(guò)24h轉(zhuǎn)化，L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量達(dá)到38mmol·L^-1，摩爾轉(zhuǎn)化率為38％(Biosci Biotechnol Biochem，2008)。Ye等在E.coli內(nèi)表達(dá)來(lái)自Thermococcuskodakarensis的蘋(píng)果酸酶，構(gòu)建了人工L-蘋(píng)果酸合成路徑實(shí)現(xiàn)葡萄糖向L-蘋(píng)果酸的代謝，過(guò)程中通過(guò)激活恩布登-邁耶霍夫糖酵解途徑(EM pathway)代謝途徑為蘋(píng)果酸酶羧化反應(yīng)提供輔因子，所制備的工程菌直接轉(zhuǎn)化葡萄糖為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸，其摩爾得率為60％(J Biotechnol，2013)。此外蘋(píng)果酸酶也被用于生產(chǎn)琥珀酸的研究中，如Stols等在E.coliNZN111菌株中過(guò)量表達(dá)內(nèi)源型的蘋(píng)果酸酶sfcA，最終使琥珀酸產(chǎn)量提高到14.1g·L^-1(Appl Microbio Biotechnol，1997)。