[發(fā)明專利]蘋果酸酶重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611046752.7
• 申請日: 2016-11-23
• 公開（公告）號: CN106591342B
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉立明;高聰;陳修來;胡貴鵬;郭亮;劉佳;羅秋玲
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 姚惠菱

1.一種蘋果酸酶重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)對來源于擬南芥的NADP依賴型蘋果酸酶基因NADP-ME₂編碼的氨基酸在E129V、E129D、S209V、I407Y、A487S、A487Y或C490S處進(jìn)行突變，得到蘋果酸酶突變基因；

(2)將所述蘋果酸酶突變基因與載體連接，然后在宿主菌中表達(dá)，得到蘋果酸酶重組菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果酸酶重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于：在步驟(2)中，所述載體為pTrc系列質(zhì)粒、pET系列質(zhì)粒、pQE系列質(zhì)粒或PY系列質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果酸酶重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于：在步驟(2)中，所述宿主菌為大腸桿菌或酵母菌。

4.一種由權(quán)利要求1-3中任一項方法構(gòu)建的蘋果酸酶重組菌。

5.一種如權(quán)利要求1-3中任一項所述的蘋果酸酶重組菌生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將所述蘋果酸酶重組菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行好氧發(fā)酵；

(2)當(dāng)所述蘋果酸酶重組菌生長至OD₆₀₀為0.4-0.8時，進(jìn)行誘導(dǎo)，然后再進(jìn)行微好氧發(fā)酵。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于：每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：20-50g葡萄糖，10-30g蛋白胨，5-20g酵母提取物，5-20g KHCO₃，2-5g(NH₄)₂HPO₄·12H₂O，0.5-2g NH₄H₂PO₄，0.1-1g KCl，0.1-1g MgSO₄·7H₂O，1-3mL微量元素液，余量為水。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于：在步驟(1)中，在25-37℃下，200-300r/min轉(zhuǎn)速的條件下進(jìn)行好氧發(fā)酵。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于：在步驟(1)中，使用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于：在步驟(2)中，在25-37℃下，低于50r/min轉(zhuǎn)速的條件下進(jìn)行微好氧發(fā)酵。