[發明專利]一種定量菌株的固態冷凍干燥物及制備方法和使用方法

有效

• 申請號: 201611046387.X
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN106635802B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 葉大林;沈志林
• 申請（專利權）人: 浙江泰林生命科學有限公司
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N1/14;C12N1/20;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/445;C12R1/385;C12R1/125;C12R1/145;C12R1/685;C12R1/725
• 代理公司: 浙江和納律師事務所 33314
• 代理人: 鄭重

本發明公開了一種定量菌株的固態冷凍干燥物及制備方法和使用方法，包括葡萄糖0.1%?0.5%、蔗糖5%?10%、明膠0.5%?1.5%、胰蛋白胨1%?2%、大豆蛋白胨0.5%?1%、氯化鈉0.5%?1%、酵母粉0.2%?0.5%和活性炭0.2%?0.5%配制成溶液作為保護劑，與稀釋后的菌懸液按一定配比混合均勻之后利用凍干成干燥制品，制品溶解性佳，1?2秒內即可完全溶解于溶解劑中。該圓柱狀凍干物中含有100cfu?1000cfu菌量或可定制特定范圍含菌數。取單個凍干物溶于N ml溶解液中，每N/10ml即含菌小于100cfu，精確方便。保護劑的使用可以大大減小凍干過程中菌株受損程度，合適的保護劑將給制品提供一個良好的形狀和凍干環境，確保菌株的活性受到最大程度的保護。溶解劑將給菌株提供良好的pH值,滲透壓及適當營養物質，以保證菌株溶解后能得到最佳的復蘇條件。

技術領域

本發明涉及一種定量菌株的固態冷凍干燥物及制備方法和使用方法，適用但不局限于制備符合中國藥典中生物檢查法要求的檢驗菌種。

背景技術

本發明接種在凍干物中的接種材料一般為單種或多種微生物，例如藥品、食品、化妝品、醫療器械等檢驗中使用到的某種菌株。所以本發明制備的凍干物可使用在多個領域中，特別是藥品、食品、化妝品等領域，適用但不局限于生物檢查法、靈敏度試驗、無菌檢查、抑菌效力檢查、定量定性對照、微生物檢驗質量控制等。

為了更好的闡述本發明，特別的以中國藥典中的生物檢查法作為典型，描述本發明。

中國藥典中指出：生物檢查法系用于檢查中國藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。無菌檢查所涉及的領域十分廣泛，且與人的身體健康、生命安全息息相關，是非常重要的環節。無菌檢查法中涉及到的多個菌株的標準菌液的制備，其要求是：所用的菌株傳代次數不超過5代；采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性；方法適用性試驗時所用菌液含菌量小于100cfu。

在傳統的菌液制備前，需要先購買標準菌株，該菌株的保存條件較高。然后接種各菌株至相應的固體或半固體培養基中，培養18h-48h，黑曲霉等更是需要培養5d-7d，最后稀釋至每毫升含菌量小于100cfu的菌懸液，該稀釋的精確度難以把控，缺點體現在以下兩方面：1.稀釋級別和最終吸取量都需要由稀釋人員根據經驗把控，但由于菌株退化或培養條件不同等原因，每次培養的菌苔活菌數偏差較大，難以做到準確；2.最終吸取的菌液含菌量需要等待計數結果出來才可以確定，而計數結果又需要數日才能確定，然而這樣做，如果含菌量超出標準范圍，但已經使用此稀釋液完成了相關實驗，實驗結果肯定不符合中國藥典要求且無法彌補。

如今各種生物制品層出不窮，保藏方法繁多，但效果最突出，使用最廣泛，最方便工業化的還是凍干。如今凍干技術發展迅速，能滿足大多凍干制品的生產。 凍干技術主要是在凍干保護劑的保護下，可將生物制品97％以上的水分除去，但盡量保持其生物活性，讓其處于一種休眠狀態。如果加適量恢復液，即可迅速溶解，并恢復其生物活性，用于后續實驗。

在現有技術中，如需獲得一定菌數含量的菌液，最主要的方法之一還是按照中國藥典所述依次稀釋，得到含菌量小于100cfu的菌液。這種方法既浪費資源又繁瑣。

發明內容

本發明將標準菌株繁殖后，稀釋至確定量的菌數后，將其與保護劑融合，并凍干，凍干后同一規格含菌量一定。一方面可減少因稀釋導致的時間、材料和人力上的浪費，另一方面可提高最終一定體積凍干物中菌含量的精確度。

本發明公開了一種定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：制備GS(Gelatin Sucrose)保護劑。所述的保護劑包括4℃保存備用的A、B部分：