[發明專利]一種定量菌株的固態冷凍干燥物及制備方法和使用方法

有效

• 申請號: 201611046387.X
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN106635802B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 葉大林;沈志林
• 申請（專利權）人: 浙江泰林生命科學有限公司
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N1/14;C12N1/20;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/445;C12R1/385;C12R1/125;C12R1/145;C12R1/685;C12R1/725
• 代理公司: 浙江和納律師事務所 33314
• 代理人: 鄭重

1.一種定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：制備GS保護劑，所述的保護劑包括4℃保存備用的A、B部分；

A部分：煮沸完全溶解于適量純化水的明膠，煮沸完全溶解于適量純化水的蔗糖，完全溶于適量純化水的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、活性炭，將上述三者混合，調節pH值至7.2±0.2，121℃滅菌15min，4℃備用；

B部分：煮沸完全溶解于適量純化水的葡萄糖，116℃滅菌15min，4℃備用；

步驟2：制備溶解劑，將含量分別為氯化鈉0.8%-1%，磷酸氫二鉀0.5%-1%，胰蛋白胨0.5%-2%，酵母粉0.5%-2%的水溶液分裝后121℃滅菌15min，制備成溶解液，4℃備用； 步驟3：制備微生物懸液，包括接種微生物到相應的培養基上培養,培養完成后用適量溶解劑洗脫菌苔或孢子，4500rpm，離心8min，棄上清，再用步驟2中適量溶解劑溶解，重復清洗兩次，最后用步驟2適量溶解劑將菌泥溶解混勻，十倍梯度稀釋至所需的稀釋級；

步驟4：將步驟3中所需稀釋級的菌液取適當量進行凍前計數；

步驟5：制備凍干菌懸液，結合步驟4的計數結果，根據凍干存活率，計算步驟3中微生物懸液所需稀釋級別，該稀釋級的菌液與GS保護劑以一定比例混合均勻制成凍干菌懸液，該菌懸液包括葡萄糖0.1%-0.5%、蔗糖5%-10%、明膠0.5%-1.5%、胰蛋白胨1%-2%、大豆蛋白胨0.5%-1%、氯化鈉0.5%-1%、酵母粉0.2%-0.5%和活性炭0.2%-0.5%以及每50ul-100ul菌懸液凍干后存活菌數在100cfu-1000cfu的活菌；

步驟6：凍干成品，上述步驟5中凍干菌懸液進行制品凍干，凍干結束后，將制品在無菌干燥環境下轉移至西林瓶中，每個西林瓶中含一個單位的圓柱形凍干制品，蓋上瓶塞，轉移回凍干機，在200mbar真空度下，25℃干燥1h，在該真空度下進行壓塞，然后放氣、出箱、壓鋁蓋。

2.如權利要求1所述的定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，其特征在于：所述的微生物包括接種于相應培養基上的細菌或/和真菌。

3.如權利要求2所述的定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，其特征在于：所述的細菌包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌或/和生孢梭菌。

4.如權利要求2所述的定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，其特征在于：所述的真菌包括黑曲霉或/和白色念珠菌。

5.如權利要求1所述的定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，其特征在于：所述的步驟5中菌懸液在無菌環境下分裝至圓柱狀模具中，放入凍干機中，-40℃預凍2h，再以200mbar的真空度，-30℃干燥8h，升溫至25℃繼續干燥，以壓升測試180sec內壓升范圍小于50mbar為判斷點結束干燥過程，將干燥完成的制品進行凍后計數，計算得到凍干后制品中活菌的存活率。

6.如權利要求1所述的定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，其特征在于：步驟6中，50ul-100ul的凍干菌懸液作為一個單位進行制品凍干。

7.一種定量菌株的固態、冷凍干燥物，其特征在于：包括葡萄糖0.1%-0.5%、蔗糖5%-10%、明膠0.5%-1.5%、胰蛋白胨1%-2%、大豆蛋白胨0.5%-1%、氯化鈉0.5%-1%、酵母粉0.2%-0.5%和活性炭0.2%-0.5%配置成溶液構成的保護劑，所述的保護劑與菌液按所需比例均勻混合被凍干制成圓柱狀的干燥物，所述的圓柱狀凍干物中含有100cfu-1000cfu存活菌量。

8.如權利要求7所述的定量菌株的固態、冷凍干燥物，其特征在于：所述的每個圓柱狀凍干物由50ul-100ul凍干菌懸液凍干而成。

9.如權利要求7所述的定量菌株的固態、冷凍干燥物，其特征在于：所述的圓柱狀凍干物中可定制特定范圍含菌數。

10.一種如權利要求7的固態、冷凍干燥物或如權利要求1制成定量菌株固態、冷凍干燥物的使用方法，其特征在于：將凍干物倒入裝有N ml溶解劑的無菌容器中，溶解該制品，混合均勻，每次取N/10ml，用于檢測，菌含量小于100cfu，所述的溶解劑包括4℃備用氯化鈉0.8%-1%，磷酸氫二鉀0.5%-1%，胰蛋白胨0.5%-2%，酵母粉0.5%-2%的水溶液分裝后121℃滅菌15min制備的溶解液，所述的N為1ml-10ml。