[發明專利]一種脫細胞角膜緣保護液及脫細胞角膜緣的制備方法

有效

• 申請號: 201611044689.3
• 申請日: 2016-11-24
• 公開（公告）號: CN106614519B
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發明（設計）人: 史偉云;周慶軍;董沐晨
• 申請（專利權）人: 山東省眼科研究所
• 主分類號: A01N1/00
• 分類號: A01N1/00;A61L27/36
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務所
• 代理人: 王加貴<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明涉及生物工程醫療材料領域，公開了一種脫細胞角膜緣保護液及脫細胞角膜緣的制備方法。本發明的脫細胞角膜緣保護液的成分為含有5～12g/L透明質酸、5～20g/L硫酸軟骨素、3～10g/L低分子右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS緩沖液。將含前彈力層的新鮮豬角鞏膜緣基質密封于所述脫細胞角膜緣保護液中，采用高靜壓處理破碎細胞；將細胞破碎后的角膜緣置于添加了去垢劑和核酸酶的所述脫細胞角膜緣保護液中進行震蕩脫細胞處理；將脫細胞后的角膜緣置于所述脫細胞角膜緣保護液中漂洗完成制備。采用本發明的方法所獲取的脫細胞角膜緣，脫細胞徹底，最小的減少了對角膜緣結構的破壞，生物相容性好，有利于自體細胞增殖爬行。

技術領域

本發明涉及生物工程醫療材料領域，尤其涉及一種脫細胞角膜緣基質。

背景技術

角膜緣是角膜和鞏膜的移行區，是角膜緣干細胞(1imbal stem cells，LSCs)的所在之處，對角膜透明性的維持和正常生理功能的發揮具有重要的作用。嚴重的眼表疾病可損傷角膜緣區，導致LSCc的缺失及屏障結構的破壞，從而引起一系列的眼表反應，甚至導致失明。例如當眼部遭受嚴重化學傷、熱燒傷等損傷后，角膜緣被廣泛破壞，部分或全部角膜緣干細胞缺乏，導致角膜上皮修復困難，結膜上皮向角膜生長，新生血管長入、角膜結膜化和基質瘢痕化，最終導致失明。

目前，同體和同種異體LSCs移植受限于匱乏的供體來源無法滿足臨床治療的需要，所以胚胎干細胞聯合組織工程負載材料制備植片進行移植是目前治療角膜緣干細胞缺乏的重要方法。角膜緣區獨特的三維組織結構及基底膜成分是LSCs賴以生存及干細胞特性維持的重要基礎之一。人類角膜緣基質是構建組織工程LSCs植片的最佳支架材料，但同樣受到供體來源匱乏的限制。目前，豬的多種脫細胞組織材料已成功應用于組織工程器官再造領域的研究。隨著生物組織工程學的廣泛和深入研究，脫細胞處理和病毒滅活等工藝制備的異種角膜基質材料在動物水平和臨床應用中取得了初步的治療效果，但鮮有脫細胞角膜緣基質的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種脫細胞角膜緣保護液，能夠避免物理、化學和生物學等處理對角膜緣三維組織結構及基底膜的破壞。

本發明的另外一個目的是提供一種脫細胞角膜緣的制備方法，該方法能保持角膜緣纖維層結構的完整，使脫細胞后的角膜緣保持其特有的纖維結構排列和生物特性，能夠作為一種應用前景很好的生物工程材料。

具體的技術方案如下：

一種脫細胞角膜緣保護液，其成分為含有5～12g/L透明質酸、5～20g/L硫酸軟骨素、3～10g/L低分子右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS緩沖液。

優選的，所述脫細胞角膜緣保護液的成分為含有7～10g/L透明質酸、10～15g/L硫酸軟骨素、5～8g/L低分子右旋糖酐和3～4mg/L妥布霉素的PBS緩沖液。

優選的，所述脫細胞角膜緣保護液的pH值為7.2～7.4。

優選的，所述脫細胞角膜緣保護液的滲透壓為300～400mOsm。

本發明還包括采用上述脫細胞角膜緣保護液制備脫細胞角膜緣的方法，包括以下步驟：

(1)將含前彈力層的新鮮豬角鞏膜緣基質密封于所述脫細胞角膜緣保護液中，采用高靜壓處理破碎細胞；

(2)將細胞破碎后的角膜緣置于添加了去垢劑和核酸酶的所述脫細胞角膜緣保護液中進行震蕩脫細胞處理；

(3)將所述脫細胞后的角膜緣置于所述脫細胞角膜緣保護液中漂洗。

其中，所述高靜壓處理破碎細胞的條件為：壓力為100～600MPa，高靜壓頻率為2～5次，每次為1～2分鐘，總時間不超過10分鐘。