[發明專利]一種離體體液中蛋白質的預處理方法

在審

• 申請號: 201611043619.6
• 申請日: 2016-11-21
• 公開（公告）號: CN108088727A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 張麗華;袁輝明;隨志剛;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N30/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種離體體液中蛋白質的預處理方法，通過一定比例的高分子聚合物溶液在低溫條件下從離體體液(血液和尿液等)中提取出蛋白質，加入一定濃度的表面活性劑和蛋白質還原劑在高溫條件下使蛋白質快速變性，加入可與蛋白質巰基快速反應的固相烷基化試劑，該試劑可選擇性與蛋白質上的巰基反應，離心后，反復清洗固相顆粒表面去除其它干擾小分子(如糖、鹽、表面活性劑、脂類等)，獲得高純度的蛋白質，最后加入蛋白酶將體液蛋白質酶解成肽段后，離心后獲得的產物可直接采用液相色譜?質譜系統進行分析。與傳統的體液蛋白質預處理方法相比，該方法具有操作簡單、重復性好、預處理通量高等優點。

技術領域

本發明涉及一種外體泌蛋白質快速預處理方法，是一種集體液分離，蛋白質提取，純化及酶解的方法。

背景技術

體液通常攜帶和傳遞著重要的信號分子。例如，研究顯示，尿液中的蛋白質主要來源于腎小球、腎小管、前列腺以及膀胱細胞，因此，對體液中超低含量的蛋白質進行高效提取，并對其蛋白質組進行分析可以直接反映人體組織、器官的生理和病理狀態。現有的體液蛋白質處理方法通常需要繁瑣的操作，多步的樣品轉移，不僅費時費力，而且損失嚴重，難以實現低豐度蛋白質的高效處理。這些問題嚴重影響了體液蛋白質組分析的準確度、靈敏度和通量。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種集體液蛋白質提取，純化及酶解的方法，整個過程可在同一個離心管中完成，避免了樣品在處理過程中轉移造成的丟失和污染。該方法可以直接處理細胞培養液和體液中的體液蛋白質，不需要復雜和繁瑣的操作，同時整個處理過程保持高度的連續性和高通量性。

為了實現該目的，本發明的技術方案是：

1、加入高分子聚合物溶液在低溫條件下提取體液中的蛋白質，其中高分子聚合物為聚合度500-10000的聚乙二醇、聚醚酰亞胺和聚乙烯醇中的一種或兩種以上，高分子聚合物溶液的質量濃度為1％-50％；高分子聚合物溶液與離體血液和/或尿液的體積比1：1-10；分離溫度范圍為-20-10℃；

2、加入表面活性劑溶液和蛋白質還原劑在高溫條件下使體液蛋白質變性；其中表面活性劑的種類可為陰離子表面活性劑(具體為十二烷基醇聚氧乙烯醚硫酸鈉,十二烷基苯磺酸,十二烷基硫酸鈉,脂肪醇羥乙基磺酸鈉,十二烷基硫酸銨中的一種或兩種以上)、陽離子表面活性劑(具體為十八烷基三甲基氯化銨,十六烷基三甲基氯化銨,二硬脂基羥乙基甲基硫酸甲脂銨中的一種或兩種以上)、兩性離子表面活性劑(具體為十二烷基甜菜堿,椰油基咪唑啉脂肪醇,聚氧乙烯醚,磺基琥珀酸二鈉鹽中的一種或兩種以上)和非離子表面活性劑(具體為椰油脂肪酸二乙醇酰胺,壬基酚聚氧乙烯醚羥基合成醇,聚氧乙烯醚,C12-14烷基糖苷中的一種或兩種以上)中的一種或兩種以上，濃度為4％-10％(質量g體積ml比)；表面活性劑溶液與步驟1)獲得溶液的體積比1：1-10；蛋白質還原劑為二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦中一種或兩種，還原劑終濃度為10mM-100mM；蛋白質提取溫度范圍為80-95℃，蛋白質還原劑為二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦中一種或兩種，還原劑終濃度為10mM-100mM；蛋白質提取溫度范圍為80-95℃；

3、加入可與蛋白質巰基快速反應的固相烷基化試劑使體液蛋白質得到分離，獲得體液蛋白質，其中固相烷基化試劑為表面共價鍵合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的聚合物微球或表面共價鍵合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯硅球，蛋白質與固相烷基化試劑的質量比為1/1-1/5；聚合物微球基質材料為聚丙烯酸酯,聚苯乙烯中的一種或兩種以上；

4、加入蛋白酶，并與固載體液蛋白質的微球在一定溫度下孵育，采用的蛋白質酶可為胰蛋白酶、賴氨酸蛋白酶和蛋白酶V8中的一種或兩種或三種；體液蛋白質與酶加入質量比為1/1-1/5，酶解溫度為25-37℃，酶解時間為0.5-4小時；

5、得到的酶解產物直接進行液相色譜-質譜分析；

6、所發展的體液蛋白質快速預處理方法用于臨床診斷、蛋白質質組學研究和腫瘤標志物篩選中的外體泌蛋白質快速預處理方法