[發(fā)明專利]云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP?OA2及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611043231.6
• 申請日: 2016-11-24
• 公開（公告）號: CN106632644A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王瀅;楊新旺;唐璟;李小潔;楊美鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 云南民族大學(xué)
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 北京匯捷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11531
• 代理人: 李宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質(zhì)，它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的抗氧化劑，這些抗氧化劑可以被分為以下兩大類：1)非基因編碼的小分子無助，如維生素E、維生素C、谷胱甘肽等；2)基因編碼的大分子物質(zhì)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白等。這些抗氧化劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，包括健康、食品、化妝品及各種工業(yè)中，比如作為燃料和潤滑劑的穩(wěn)定劑防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合從而避免引擎積垢形成的目的，單在2007年，工業(yè)用途的抗氧化劑的就創(chuàng)造了大約37億美元的收入。基于抗氧化劑的重要性，科學(xué)家們一直在孜孜不倦的尋找著新型抗氧化劑。

兩棲動物是水生動物過度到陸生動物之間的重要類群，其皮膚裸露，表面沒有毛發(fā)覆蓋，直接面對各種生存壓力，承當(dāng)著諸多重要的生物學(xué)功能，比如抵御微生物入侵、體色調(diào)節(jié)、水鹽平衡調(diào)節(jié)等。已經(jīng)有大量的研究證據(jù)表明，兩棲動物的皮膚能分泌大量的活性物質(zhì)(主要是蛋白和多肽)使得其能完成這些重要的生物學(xué)功能。最近，在兩棲動物滇蛙的皮膚中發(fā)現(xiàn)了一類新型的抗氧化劑，其化學(xué)本質(zhì)為多肽，和傳統(tǒng)的兩大類抗氧化劑不同，其由基因編碼，但分子量卻很小。此后，在一些兩棲動物皮膚中也發(fā)現(xiàn)了這一類物質(zhì)，但和傳統(tǒng)的抗氧化劑相比，我們對這一類新型抗氧化劑的結(jié)構(gòu)和功能了解還知之甚少。

云南臭蛙是中國特有的一種兩棲動物，廣泛分布于強(qiáng)紫外照射的云貴高原，根據(jù)其生境，我們推測其皮膚能分泌高效的新型抗氧化多肽使得其能抵御紫外照射所造成的傷害。對這些多肽的挖掘、結(jié)構(gòu)和功能的研究一方面為我們理解兩棲動物適應(yīng)高海拔強(qiáng)紫外照射生境提供新的分子線索，另外一方面能為我們提供新的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗氧化劑。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2及其制備方法與應(yīng)用，通過云南臭蛙皮膚分泌分離純化得到的AOP-OA2具有結(jié)構(gòu)新穎、簡單、活性強(qiáng)的特點(diǎn)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2，抗氧化多肽AOP-OA1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還公開了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2的制備方法，包括以下步驟：

1)原料預(yù)處理：取云南臭蛙皮膚分泌物，溶解于質(zhì)量濃度為0.9％的生理鹽水，真空冷凍干燥，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)Sephadex G50分子篩：將步驟1)中制備得到的云南臭蛙皮膚分泌物凍干粉溶解于去離子水中，上Sephadex G50柱子，用Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為2.0毫升/10分鐘，每10分鐘收集一管，測定其在280納米下的吸光度，收集合并具有抗氧化活性的洗脫峰；

3)高效液相色譜反相層析：將步驟2)中制備得到的洗脫液上樣于Hypersil ODS2柱子，實(shí)驗儀器為Waters 1525高壓液相系統(tǒng)，在流速為1毫升/分鐘的條件下，用乙腈在線性梯度條件下進(jìn)行洗脫，監(jiān)測波長為215納米，收集合并具有抗氧化活性的洗脫峰，濃縮干燥后得到目標(biāo)物。

進(jìn)一步地，步驟2)中的Sephadex G50柱子預(yù)先用20mM、pH6.8、含0.1M NaCl的Tris-HCl緩沖液平衡24h。

進(jìn)一步地，步驟3)中的Hypersil ODS2色譜柱需預(yù)先用含體積濃度為0.1％三氟乙酸的超純水平衡。

進(jìn)一步地，步驟3)中的乙腈為含0.1％三氟乙酸的乙腈。

進(jìn)一步地，步驟3)中的線性梯度洗脫具體為：乙腈濃度從0％升至60％所消耗的時間為60分鐘。

本發(fā)明還公開了一種上述云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2在制備與抗氧化相關(guān)的藥物、保健品、化妝品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明從中國產(chǎn)云南臭蛙的皮膚中得到了1個新的抗氧化多肽AOP-OA2，其抗氧化活性很強(qiáng)，約為維生素E的300倍。將本發(fā)明的云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。

2)純化得到的云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2在自由基ABTS+清除實(shí)驗中顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性，揭示本發(fā)明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2有潛在的應(yīng)用前景。

3)云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2具有結(jié)構(gòu)簡單、抗氧化活性強(qiáng)的特點(diǎn)。