[發(fā)明專利]一種用于鑒定甜瓜抗蔓枯病的專用引物及分子標(biāo)記方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611032338.0
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN106701917B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華德平;劉莉;付金玉;李三培;楊旭輝
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

本發(fā)明提供了一種鑒定甜瓜抗蔓枯病的專用引物及分子標(biāo)記方法；針對目前甜瓜在抗蔓枯病育種工作中存在的問題，如人工接種致病菌，鑒定蔓枯病抗性存在不準(zhǔn)確、工作量大的缺點(diǎn)，通過提取甜瓜待檢測樣品的基因組DNA作為模板，利用分子標(biāo)記專用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，再通過電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。提供了一種鑒定甜瓜蔓枯病抗性SSR分子標(biāo)記及其專用引物，在甜瓜植株早期，就可完成對抗蔓枯病和不抗蔓枯病的甜瓜材料進(jìn)行篩選的目的，具有鑒定準(zhǔn)確，不受發(fā)病條件的限制，取材方便等優(yōu)點(diǎn)。利用本發(fā)明進(jìn)行甜瓜輔助育種，具有選擇目標(biāo)明確，節(jié)約育種時(shí)間和人工成本，提高育種效率等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鑒定甜瓜蔓枯病抗性的專用引物及分子標(biāo)記方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甜瓜(Cucumis melo L.)屬葫蘆科黃瓜屬草本植物，其果實(shí)具有甜、香、脆等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。各種病蟲害，對甜瓜的生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響，降低了甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，為防治病蟲害的發(fā)生，增加了甜瓜的生產(chǎn)成本，同時(shí)造成生態(tài)環(huán)境的破壞。

甜瓜蔓枯病(Gummy stem blight，GSB)是由子囊菌瓜類黑腐小球殼菌(Didymellabryoniae(Auersw)Rehm)引起的一種世界性的土傳真菌病害，又稱黑腐病、油秧病，致病菌無生理小種的發(fā)現(xiàn)。該病每年都給甜瓜造成巨大危害，特別是在高溫高濕條件下，發(fā)病更加嚴(yán)重。化學(xué)方法是目前防治蔓枯病最常用的措施，成本較高，對環(huán)境不友好，易造甜瓜的成農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題。通過篩選抗蔓枯病的甜瓜種質(zhì)資源，培育抗蔓枯病的甜瓜品種是防治甜瓜蔓枯病最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。

傳統(tǒng)育種對甜瓜新品種的選育做出了巨大貢獻(xiàn)，不過傳統(tǒng)育種需要采用傳統(tǒng)的雜交、回交和表型選擇等工作，存在工作量大，育種周期長，受環(huán)境因素影響大等因素，分子標(biāo)記輔助育種是利用物種的特定遺傳標(biāo)記與特定表型間的連鎖性，通過檢測分子標(biāo)記，從基因型水平篩選種質(zhì)資源，已被廣泛應(yīng)用到育種工作中，能夠減少傳統(tǒng)育種工作的工作量，縮短育種周期，具有較好的效果。篩選連鎖型好，區(qū)分度高的分子標(biāo)記及其專用引物，是分子標(biāo)記輔助育種得以應(yīng)用的前提條件。

隨著甜瓜基因組測序的完成，特別是甜瓜各種SSR和SNP分子標(biāo)記的公布，已有關(guān)于甜瓜抗蔓枯病種質(zhì)資源和分子標(biāo)記的報(bào)道。已報(bào)道的甜瓜抗蔓枯病的種質(zhì)資源有Pl140471、Pl157082、Pl511890、Pl482398、Pl482399和Pl420145，其抗性基因分別為Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5和Gsb-6，不過至今為止，還沒有任何一個(gè)甜瓜抗蔓枯病的基因被成功定位和克隆。除Gsb-5為抗蔓枯病隱性基因外，其余都為抗蔓枯病的顯性基因。劉文睿等設(shè)計(jì)了與Gsb-1連鎖的分子標(biāo)記CMCR505，張永冰等利用ISSR技術(shù)獲得了與Gsb-2連鎖的分子標(biāo)記ISSR-57₅₆₀，王紅英等篩選出與GSb-4連鎖的SSR分子標(biāo)記CMTA170a、SCAR分子標(biāo)記SCAR_GB1，畢研飛等創(chuàng)建了與Gsb-6連鎖的分子標(biāo)記SGSB1800。這些抗蔓枯病甜瓜種質(zhì)資源的發(fā)現(xiàn)和分子標(biāo)記的開發(fā)，輔助了甜瓜抗蔓枯病新品種的培育。

甜瓜種質(zhì)資源異常豐富，目前公布的抗蔓枯病的種質(zhì)資源和分子標(biāo)記數(shù)目較少，不能覆蓋所有抗蔓枯病的甜瓜種質(zhì)材料，且有些分子標(biāo)記的特異性和連鎖性較差，嚴(yán)重制約了甜瓜抗蔓枯病新的種質(zhì)資源的開發(fā)和利用。需要篩選新的抗蔓枯病的甜瓜種植資源和分子標(biāo)記，用于甜瓜抗蔓枯病的分子輔助育種工作。

發(fā)明內(nèi)容

針對目前甜瓜在抗蔓枯病育種工作中存在的問題，如人工接種致病菌，鑒定蔓枯病抗性存在不準(zhǔn)確、工作量大的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種鑒定甜瓜蔓枯病抗性SSR分子標(biāo)記及其專用引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)，在甜瓜植株早期，就可完成對抗蔓枯病和不抗蔓枯病的甜瓜材料進(jìn)行篩選的目的，具有鑒定準(zhǔn)確，不受發(fā)病條件的限制，取材方便等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：