[發明專利]脂蛋白a的酶聯免疫試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201611030424.8
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN107037217B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 陳立國;鄒偉權;張亞麗;李慶祥;母潤紅;王濤;蘇焱
• 申請（專利權）人: 廣州華弘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司44416
• 代理人: 張帥

技術領域

本發明屬于醫療檢測領域，具體涉及一種用于檢測磷酸化脂蛋白(a)的酶聯免疫試劑盒及其制備方法。

背景技術

動脈粥樣硬化(atherosclerosisAS)是指有動脈壁增厚、變硬及彈性降低,并以動脈內膜形成粥樣斑塊為特征的病變。目前對于其發病原因尚未完全確定,可能與年齡、性別、血脂異常、高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖、感染等因素有關。高膽固醇濃度,脂蛋白a是AS的一個主要的危險因子。

脂蛋白(a)是人血漿中的一類特別的脂蛋白顆粒，最早由Kare Berg于1963年發現，主要由低密度脂蛋白顆粒和富含糖鏈的高度親水的apo(a)組成；其中每個apo(a)分子通過一個二硫鍵和一分子的apoB-100共價交聯。Apo(a)由三個完全不同的結構組成：未激活的蛋白酶區域、一個拷貝的K5環餅和多拷貝的K4環餅區。

研究表明，人血漿中Lp(a)濃度的升高與心血管功能的紊亂及腦血管疾病相關，血漿中Lp(a)濃度的升高通常預示著早期的冠狀動脈和梗阻風險的增加，同時由于Lp(a)基本濃度具有高度的遺傳性，因此，Lp(a)是早期冠心病(CHD)的重要預示因子，對其進行檢測對于心血管疾病的預測具有重要意義。

目前，已知的檢測脂蛋白(a)濃度的方法有免疫比濁法、放射免疫法、熒光免疫測定法等檢測方法，但上述測定方法的操作比較復雜，檢測用時長或者靈敏度較低等缺點，不適合做常規檢測。

發明內容

本發明的第一方面是提供一種脂蛋白a的酶聯免疫檢測試劑盒，其由以下成分組成：(1)包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板；(2)脂蛋白a系列標準品；(3)酶標記抗體溶液；(4)稀釋液；(5)洗滌液；(6)底物液；(7)顯色液；(8)終止液。

所述脂蛋白a系列標準品的脂蛋白a含量為：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/L PBS緩沖液，并且每升標準品溶液中含有5gBSA和10g蔗糖。

所述酶標記抗體溶液為含5mg/L的HRP標記的抗脂蛋白a抗體、0.5mg/L的甘油單蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/L PBS緩沖液，pH值為8.0。

所述稀釋液為50mmol/L的PBS(pH7.4)緩沖液；

所述洗滌液為50mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液。

所述底物液為磷酸-檸檬酸緩沖液(pH7.4)配制的5％過氧化氫溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氫鈉；

所述顯色液為四甲基聯苯胺(TMB)的甲醇溶液，濃度為0.5mg/ml；

所述終止液為3mol/L硫酸。

本發明的第二方面是提供所述試劑盒的制備方法，具體步驟如下：

(1)包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板的制備：

a、抗體稀釋:用pH為8.0的50mM的Tris-HCl緩沖溶液將抗脂蛋白a單克隆抗體稀釋到10μg/ml，得包被液；

b、包被:取微孔板，用洗滌液洗滌3次，加入上述含抗脂蛋白a單克隆抗體的包被液，每孔100μL/孔，4℃孵育12小時；

c、封閉:傾去包被液，置于吸水紙上輕拍幾次，去除殘液，加入含重量百分比為0.1％的甘油單蓖麻油酸酯、0.5％的BSA和1％蔗糖的濃度為50mmol/L的Tris-HCl封閉液，其pH為8.0，300μl/孔，室溫，1小時；

d、真空干燥，密封，即得包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板。

(2)酶標記抗體溶液制備：

a、將10mg HRP溶于1ml蒸餾水中并加入新鮮配制的0.06mol/L NaIO₄1ml,混勻于4℃放置30分鐘；

b、加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室溫放置30分鐘；

c、加入含5mg抗脂蛋白a抗體的水溶液2ml,然后于4℃下，對0.05mol/L碳酸緩沖液(pH9.6)透析過夜；

d、吸出透析袋內溶液，加入0.5ml NaBH₄,4℃下放置2小時；

e、滴加等體積飽和(NH₄)₂SO₄溶液，4℃下放置30分鐘；

f、上述溶液2500rpm離心10分鐘，去除上清液，沉淀用少許0.2mol/L pH7.4的PBS溶解，并于4℃下對此緩沖液透析過夜；

g、吸出透析袋內溶液，離心除去不溶物，上清液過葡聚糖層析柱，用0.2mol/L pH7.4的PBS洗脫，收集洗脫液，即為純化的酶標記抗體；