[發明專利]脂蛋白a的酶聯免疫試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201611030424.8
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN107037217B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 陳立國;鄒偉權;張亞麗;李慶祥;母潤紅;王濤;蘇焱
• 申請（專利權）人: 廣州華弘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司44416
• 代理人: 張帥

1.一種脂蛋白a的酶聯免疫檢測試劑盒，其由以下成分組成：（1）包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板；（2）脂蛋白a系列標準品；（3）酶標記抗體溶液；（4）稀釋液；（5）洗滌液；（6）底物液；（7）顯色液；（8）終止液；

所述酶標記抗體溶液為含5 mg/L的HRP標記的抗脂蛋白a抗體、0.5 mg/L的甘油單蓖麻油酸酯和0.5 mg/L的BSA的50 mmol/L PBS緩沖液，pH值為8.0；

所述底物液為pH值為7.4的磷酸-檸檬酸緩沖液配制的5％過氧化氫溶液，并且溶液中含0.1 mg/L的焦磷酸二氫鈉；

所述的酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法，具體步驟如下：

（1）包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板的制備：

a、抗體稀釋:用pH為8.0的50 mM的Tris-HCl緩沖溶液將抗脂蛋白a單克隆抗體稀釋到10 μg/ml，得包被液；

b、包被:取微孔板，用洗滌液洗滌3次，加入上述含抗脂蛋白a單克隆抗體的包被液，每孔100 μL/孔，4℃孵育12小時；

c、封閉:傾去包被液，置于吸水紙上輕拍幾次，去除殘液，加入含重量百分比為0.1%的甘油單蓖麻油酸酯、0.5%的BSA和1%蔗糖的濃度為50 mmol/L的Tris-HCl封閉液，其pH為8.0，300 μl/孔，室溫，1小時；

d、真空干燥，密封，即得包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板；

（2）酶標記抗體溶液制備：

a、將10 mg HRP溶于1 mL蒸餾水中并加入新鮮配制的0.06 mol/L NaIO₄ 1 mL,混勻于4℃放置30分鐘；

b、加入0.16 mol/L乙二醇水溶液1 mL，室溫放置30分鐘；

c、加入含5 mg抗脂蛋白a抗體的水溶液2 mL，然后于4℃下，對0.05 mol/L pH 9.6的碳酸緩沖液透析過夜；

d、吸出透析袋內溶液，加入0.5 mL NaBH₄，4℃下放置2小時；

e、滴加等體積飽和（NH₄）₂SO₄溶液，4℃下放置30分鐘；

f、上述溶液2500 rpm離心10分鐘，去除上清液，沉淀用少許0.2 mol/L pH 7.4的PBS溶解，并于4℃下對此緩沖液透析過夜；

g、吸出透析袋內溶液，離心除去不溶物，上清液過葡聚糖層析柱，用0.2 mol/L pH7.4的PBS洗脫，收集洗脫液，即為純化的酶標記抗體；

h、將收集的酶標記抗體除菌過濾，配制成酶標記抗體溶液，具體為含5 mg/L的HRP標記的抗脂蛋白a抗體、0.5 mg/L的甘油單蓖麻油酸酯和0.5 mg/L的BSA的50 mmol/L PBS緩沖液，pH值為8.0；

（3）標準品、稀釋液、洗滌液、底物液、顯色液和終止液，按照本領域常規的溶液配制方法制備。

2. 根據權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述脂蛋白a系列標準品的脂蛋白a含量為：0、10、50、100、200、400和600 mg/L的50 mmol/L PBS緩沖液，并且每升標準品溶液中含有5g BSA和10g蔗糖。

3. 根據權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述稀釋液為50 mmol/L pH 7.4的PBS緩沖液；所述洗滌液為50 mmol/L pH 7.4的PBS配制的0.05％吐溫20溶液。

4.根據權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述顯色液為四甲基聯苯胺（TMB）的甲醇溶液，濃度為0.5mg/ml；所述終止液為3mol/L硫酸。