[發明專利]用于篩選強遷移能力的臍帶間充質干細胞的流式試劑盒

有效

• 申請號: 201611029636.4
• 申請日: 2016-11-14
• 公開（公告）號: CN106755262B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 張碩;馬潔
• 申請（專利權）人: 天津市康婷生物工程集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N15/14
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發明涉及一種用于篩選具有較強遷移能力的臍帶間充質干細胞的流式檢測試劑盒，試劑盒組成包括：標準直徑微球、PE?CD105、APC?CD73、FITC?CD90、PerCP?Cy5.5?CD166、FITC?CD11b、PE?CD34、PE?CD45、PE?CD19、PE?CD80、PE?CD86、FITC?HLA?DR及相應的同型對照抗體。本發明通過設置標準“Gate”和增加檢測CD166使檢測結果直接與細胞制劑的遷移能力與有效性相關聯；本發明確保多種免疫排斥相關的細胞表面標志物如CD80\CD86為陰性，從而保證臨床患者人身安全；本發明減少了檢測細胞表面標志物的過程中對細胞樣本的消耗量。

技術領域

本專利主要用于臍帶間充質干細胞制劑的質量控制，并可為相關研究提供評估細胞遷移能力的方法，尤其是一種用于篩選強遷移能力的臍帶間充質干細胞的流式試劑盒。

背景技術

臍帶間充質干細胞(UC-MSC,umbilical cord mesenchymal stem cells)是間充質干細胞家族的重要成員，屬于多能干細胞。臍帶間充質干細胞具有較高的分化潛能，可向軟骨、脂肪、內皮等多個方向分化，并具有一定的免疫調控作用，此外，UC-MSC與廣為人知的骨髓間充質干細胞(BM-MSC，bone marrow mesenchymal stem cells)相比，具有來源豐富、制備簡單等優點。目前，UC-MSC制劑在骨關節疾病、神經退行性疾病、糖尿病等疾病的治療中均展現出良好的臨床應用前景，CFDA也于2015年8月21日發布了《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》。

根據《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》中“干細胞制劑的質量控制—干細胞制劑的檢驗—細胞檢驗”所述，應對細胞表面標志物進行純度檢測，以確保干細胞治療的安全性和有效性。然而，實踐表明通過流式細胞術檢測得到相近純度的不同細胞樣本，卻在遷移能力等方面存在較大差異，這將直接影響制劑的有效性。此外，考慮到干細胞制劑涉及到臨床應用，最大限度保障患者人身安全更是純度檢測過程中的重中之重。因此確立一套更為精準有效且能反應細胞制劑安全性與有效性的細胞表面標志物檢測方法已成為業內公認的難題。

目前業內普遍采用P2-P5代臍帶間充質干細胞用于臨床前研究，實踐表明每根臍帶經剪切分離法平均僅可獲得約1.98*10⁷的P1代臍帶間充質干細胞，因此降低質量控制過程中對細胞樣本的消耗顯得尤為重要。然而通過流式細胞術的方法對UC-MSC的表面標志物進行檢測時，需滿足以下多種條件方能保證檢查的準確度。

首先，目前業內公認的最優檢測體系為每管含0.5mL密度為1*10⁶的細胞樣本，檢測管數由需要檢測的表面標志物種類決定；其次，考慮到使用不同熒光染料進行多色標記時，發射光會溢漏至其他檢測通道中，需要使用單色光對照管和FMO對照管以獲得準確的實驗數據；若使用單色染料進行檢測，由于臍帶間充質干細胞的特性，需檢測多種陽性表面標志物，同樣會導致樣本管數增加，造成樣本損失。此外，考慮到目前流式細胞儀的市場應用情況，目前主流的流式細胞儀的配置多為488nm和633nm雙波長激發光，除兩個散射光檢測通道外，一般只配備4-8個發射光檢測通道?？偟膩碚f，如何在控制細胞樣本消耗量和保證檢測精度之間找到平衡點，設計出一套適用于主流流式細胞儀的實驗方案成為了臍帶間充質干細胞純度檢測的一大難點。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種用于篩選具有較強遷移能力的臍帶間充質干細胞的流式檢測試劑盒。本發明通過對檢測方法進行優化，從而使檢測結果與細胞樣本的遷移能力與有效性直接關聯。

本發明采用的技術方案是：

一種用于篩選具有較強遷移能力的臍帶間充質干細胞的流式檢測試劑盒，試劑盒組成：具體說明如下：