[發(fā)明專利]一種豬多殺性巴氏桿菌病抗原的制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611026618.0
• 申請日: 2016-11-11
• 公開（公告）號: CN106692962A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖華春;王成業(yè);汪鑫鑫;李玉梅;王楠楠
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽東方帝維生物制品股份有限公司
• 主分類號: A61K39/102
• 分類號: A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙)11470
• 代理人: 劉曄

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬多殺性巴氏桿菌病抗原的制備方法及其應(yīng)用，屬于獸用生物制品的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬多殺性巴氏桿菌病是豬的一種急性敗血性傳染病，主要使動物發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎，可在同種或不同動物間相互傳染，也可感染人。根據(jù)病程長短分為最急性型、急性型和慢性型。急性型病例呈現(xiàn)出血性敗血癥、咽喉炎和肺炎癥狀；慢性病例主要表現(xiàn)為慢性肺炎。該病一年四季均可發(fā)生，多繼發(fā)于傳染病之后，在世界各地都有發(fā)生，有時也呈地方流行，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，造成巨大的損失。采用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防是國內(nèi)外控制豬巴氏桿菌病的根本手段。現(xiàn)有技術(shù)中，豬多殺性巴氏桿菌病抗原(EO630株)的培養(yǎng)按照傳統(tǒng)方法(《中華人民共和國獸醫(yī)用生物制品規(guī)程》二OOO版)是按1～2％把菌種接種至馬丁肉湯中，以逐漸增大通氣量的方法培養(yǎng)，在通氣培養(yǎng)9小時活菌數(shù)達(dá)到最高峰，即可收獲抗原，此時活菌計數(shù)為6.1×10⁹～7.5×10⁹CFU/mL。

按照上述傳統(tǒng)發(fā)酵工藝方法進(jìn)行培養(yǎng)，由于在細(xì)菌的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)、糖等營養(yǎng)成分不斷被消化，產(chǎn)生的細(xì)菌代謝產(chǎn)物越來越多，對細(xì)菌的繼續(xù)增值造成了影響。當(dāng)細(xì)菌增值到一定程度后，如果沒有對營養(yǎng)成分補(bǔ)充，細(xì)菌增值達(dá)到高峰后，活菌數(shù)很難再提高。因此，最終的活菌計數(shù)為6.1×10⁹～7.5×10⁹CFU/mL。另外，制造疫苗時要求每頭份疫苗活菌數(shù)不少于5億(內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))，每瓶疫苗(以50頭份/瓶計)需要250億活菌。所以要達(dá)到這個標(biāo)準(zhǔn)，每瓶疫苗的裝量需要5.0ml。但我們凍干疫苗的最佳裝量應(yīng)不超過3.0ml。按這個標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)菌數(shù)還需要提高40％以上。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有傳統(tǒng)制備方法存在的問題，本發(fā)明提供一種豬多殺性巴氏桿菌病抗原的制備方法及應(yīng)用，能夠大大提高活菌的數(shù)目，降低抗原的使用量，同時，提高疫苗質(zhì)量，并降低生產(chǎn)成本。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的一種豬多殺性巴氏桿菌病抗原的制備方法， 其特征在于，該方法的操作步驟如下：

(1)、培養(yǎng)基的制備和消毒：領(lǐng)取豬肺疫干粉培養(yǎng)基，按照每次培養(yǎng)10萬毫升/罐的比例加入注射用水進(jìn)行配制，然后在116℃的溫度下，在發(fā)酵罐內(nèi)持續(xù)30分鐘的消毒滅菌，最后冷卻至37℃準(zhǔn)備接種；

(2)、細(xì)菌接種：將上述步驟(1)制得的培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基總量的2％接種細(xì)菌種子液，將保存?zhèn)溆玫募?xì)菌種子液2000ml移入無菌室，同時，按發(fā)酵罐培養(yǎng)基總量加入0.1％裂解血球全血，最后連接接種的各路管道，利用潔凈空氣將菌種壓入發(fā)酵罐內(nèi)；

(3)、細(xì)菌培養(yǎng)：細(xì)菌接種完畢后，37℃靜止培養(yǎng)1小時，繼續(xù)通氣培養(yǎng)，在通氣培養(yǎng)到7-10小時內(nèi)向發(fā)酵罐內(nèi)添加一定量的上述步驟(1)所制得的經(jīng)滅菌的新鮮培養(yǎng)基，然后繼續(xù)通氣培養(yǎng)直至培養(yǎng)結(jié)束，對抗原取樣進(jìn)行活菌計數(shù)，測定生長曲線。

優(yōu)選地，所述步驟(3)在通氣培養(yǎng)至7-10小時內(nèi)一次性向發(fā)酵罐內(nèi)添加百分比為20％的新鮮培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述步驟(3)在通氣培養(yǎng)至7-10小時內(nèi)分兩次向發(fā)酵罐內(nèi)添加百分比為7-15％的新鮮培養(yǎng)基，優(yōu)選為,培養(yǎng)至7小時和培養(yǎng)至9小時時向發(fā)酵罐內(nèi)添加百分比為10％的新鮮培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述方法制備的抗原可應(yīng)用于疫苗的制造。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明對現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝作了微小調(diào)整，在細(xì)菌培養(yǎng)的中后期增加了新鮮培養(yǎng)基，及時對細(xì)菌發(fā)酵消耗的營養(yǎng)成分進(jìn)行了有效的補(bǔ)充，同時稀釋有害代謝產(chǎn)物，因而使得培養(yǎng)菌數(shù)有明顯的增長，培養(yǎng)結(jié)束時活菌計數(shù)為9.8×10⁹～1.3×10¹⁰CFU/mL，大大提高了培養(yǎng)菌數(shù)。另外，在應(yīng)用于豬多殺性巴氏桿菌病(EO630株)活疫苗的生產(chǎn)制造時，每瓶疫苗(以50頭份/瓶計)只需要2.6ml的抗原就超過250億活菌的標(biāo)準(zhǔn)，具有提高質(zhì)量和降低成本的雙重效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中7小時補(bǔ)料發(fā)酵工藝曲線；

圖2是本發(fā)明中8小時補(bǔ)料發(fā)酵工藝曲線；

圖3是本發(fā)明中9小時補(bǔ)料發(fā)酵工藝曲線；

圖4是本發(fā)明中分段補(bǔ)料10％發(fā)酵工藝曲線；

圖5是本發(fā)明中分段補(bǔ)料7％發(fā)酵工藝曲線；

圖6是本發(fā)明中分段補(bǔ)料15％發(fā)酵工藝曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述和論證。