[發明專利]人工表皮片、其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201611026605.3
• 申請日: 2016-11-14
• 公開（公告）號: CN107338216A
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發明（設計）人: 仁科博道;吳復躍;何振東
• 申請（專利權）人: 上海睿泰生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38;A61L27/60;C12Q1/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 張靜

技術領域

本發明涉及生物制品領域；具體地，涉及共同培養表皮細胞與黑素形成細胞以形成人工表皮片的方法，以及上述人工表皮片在醫療、美容和/或物質篩選中的應用。

背景技術

皮膚指身體表面包在肌肉外面的組織，是人體最大的器官，主要承擔著保護身體、排汗、感覺冷熱和壓力等功能。皮膚覆蓋全身，它使體內各種組織和器官免受物理性、機械性、化學性和病原微生物性的侵襲。由于外界原因和/或生物體自身原因，皮膚可能會發生各種損傷和/或病變，其中有些損傷或病變不僅涉及皮膚表皮細胞，還涉及皮膚中的黑素細胞的缺失或損傷(例如白癜風)。

普通白癜風是一種因皮膚黑素細胞缺失所致的疾患。其主要病因是黑素細胞自毀，從而被視為一種自身免疫疾病。白癜風的患部會因黑色素缺失而形成白斑，從而與身體其它部位產生明顯色差。

目前，針對白癜風一般會采用涂抹甾類化合物軟膏、活性型維他命軟膏等藥物的治療方式，有時也會采用他克莫司等免疫抑制劑來進行治療。此外，現有療法還包括：PUVA療法、短波長紫外線療法，以及癥狀發展至全身時采用的內服甾類化合物的療法。然而，上述療法均存在療效不足、治療后患部仍逐步擴大等問題。

然而，當身體開始對藥物產生耐藥性時，上述療法無法達到預期效果，且癥狀將逐步擴大。在此情況下，可采用另一種療法，即從患者正常部位獲取皮膚，并進行移植。這種療法的缺點在于，無法進行大面積的移植¹。

還可采用的另一種療法是：從患者患部以外的、不明顯的正常身體部位采集一小塊皮膚，利用該皮膚進行角質形成細胞培養，并將培養獲得的表皮皮片移植到患部。研究結果表明，這種療法對于節段型白癜風有效。其之所以有效，主要是基于白癜風的病理學：攻擊自身黑素細胞的免疫細胞侵入表皮，這不僅 造成黑素細胞的死亡，連周邊的角質形成細胞也一同被殺滅²。許多報告表明，白癜風中，患部的角質形成細胞也受到損傷^3-7。

據研究報道，正常情況下，角質形成細胞在UVB的照射下會釋放出多種物質，這些物質會促進毛囊部黑素形成細胞的增殖和分化^8,9。然而，受損的角質形成細胞則缺失上述能力，這也是大多數UVB療法失效的原因。相反，只要將患部的角質細胞替換成正常的表皮角質細胞，就能夠治療白癜風。這就是移植正常表皮皮片能夠治愈白癜風的原因之一。

然而，上述這種療法的有效性僅限于針對節段型白癜風的治療，其對于出現在兩側的全身型白癜風是無效的。

根據如前文獻報道，白癜風患部的黑素細胞會因受到免疫細胞的攻擊而死亡。不過，在毛囊根部區域可能仍存在一些不具有被免疫細胞識別的抗原的黑素形成細胞，因為未受到攻擊而得以生存。由此，多數的UVB療法也正是利用該原理，使該部位的表皮細胞活化，分泌對黑素形成細胞的移動、分化和/或成熟有利的細胞因子，使黑素形成細胞產生黑色素。但是，如果該部位的黑素形成細胞也受到傷害，則不僅UVB療法會失效，移植正常的角質形成細胞也仍然達不到治療效果。而在僅僅移植黑素細胞的情況中，若免疫細胞活動頻繁，黑素細胞的存活率也會受到免疫細胞攻擊的影響而低下¹⁰。

目前，雖然已報道了幾種無血清、無飼養層細胞的皮膚角質形成細胞培養方法，但是在無血清的狀態下使細胞分化，并由此獲得可以進行移植的皮片的培養方法至今無報道。并且，本領域中也從未曾嘗試并開發出使這樣的皮片中含有黑素形成細胞，并使其與表皮細胞共同增殖、分化的培養方法。

因此，本領域仍需要用以治療白癜風的高安全性新型產品和技術手段。并且，除了針對白癜風之外，本領域也仍需要用于治療或美化其他涉及皮膚表皮以及黑素形成細胞受損的皮膚癥狀和/或疾病(例如皮膚燒傷、灼傷、疤痕等)的高安全性新型產品和技術手段。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種人工表皮片，所述人工表皮片的培養與制備過程安全性高。并且，所制得的人工表皮片還包含黑素形成細胞，這對于需要皮膚移植和/或皮膚修補的疾病(如白癜風)和/或狀況(如美容相關狀況)而言是極為有利的。

本發明的第一方面提供一種人工表皮片，其包含：活的黑素形成細胞和表皮細胞，其中，所述人工表皮片不包含動物源性的血清和蛋白質以及營養支持細胞。

在一些實施方式中，所述人工表皮片不包含腦衍生物質和動植物源性的過敏原物質；在另一實施方式中，所述人工表皮片還包含用于支持所述黑素形成細胞和表皮細胞的支持材料，例如纖維蛋白凝膠。

本發明的第二方面提供一種制備人工表皮片的方法，其包括如下步驟：