[發明專利]一種DNA序列編輯的方法

有效

• 申請號: 201611022023.8
• 申請日: 2016-11-21
• 公開（公告）號: CN108085328B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 王金;趙國屏;張宏
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 陳詳;陸鳳

本發明提供了一種DNA序列編輯的方法，具體地本發明的方法采用兩步替換法來進行DNA序列編輯，其中第一步為替換目標位點附近的一段序列(或為插入一段外源的DNA序列)，第二步將替換(或插入)的外源DNA序列切開，篩選外源DNA重組片段與基因組進行DNA重組之后得到的細胞，從而上述目標位點附近的序列替換為目標序列。結合CRISPR技術或其它技術，本發明可以高效、快速地進行染色體任意位點，并且可以進行任何形式的突變(包括突變、刪除、插入外源DNA序列)等。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地本發明涉及一種DNA序列編輯的方法，尤其涉及一種能夠快速、高效進行基因組定點突變、刪除和定點插入外源DNA序列的方法。

背景技術

基因組編輯是指在基因組上進行特定位點的突變、敲入、刪除等。該技術不僅在科研領域受到了極大重視，而且在農業和醫療領域的潛力也備受關注。具體的應用包括：(1)構建模式動物，幫助科學研究；(2)改造植物的性狀，提高作物產量和逆境耐受能力等；(3)檢測和改造人的基因，達到精準醫療的目的等。

得益于宿主自身的同源重組，科學家能夠對基因組DNA進行基因敲除、外源DNA插入等實驗。然而，由于同源重組的效率比較低，需要引入篩選標記(如抗性基因DNA序列等)以用于后續的篩選，從而實現基因敲除和DNA插入的目的。到了2000年，Barry L.Wanner實驗室開發了Red重組系統，大大提高了DNA重組的效率，也降低了對重組的DNA同源臂長度的要求(只需要36-50nt的同源序列即可)(Kirill A.Datsenko and Barry L.Wanner(2000).One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.PNAS,97,6640-6645)。盡管如此，進行基因組編輯時，還是需要引入抗性基因等篩選標記以用于陽性克隆的篩選。為了去除陽性克隆內的篩選標記序列，需要在篩選標記序列兩端加入FRT等重組位點，并通過引入Flp重組酶來介導兩個FRT位點間進行位點特異性重組，以刪除兩個FRT位點間的篩選標記序列。類似的位點特異性重組系統還包括Cre重組酶和LoxP重組位點等。這類技術雖然可以成功消除篩選標記序列，但是會留下一個FRT重組位點(或其它類似重組位點)，無法實現基因組無痕編輯(如定點突變等)的需求。

然而，要在哺乳動物細胞的基因組上進行定點編輯等實驗仍然比較麻煩，而且效率很低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種DNA序列編輯的方法及適用該方法的試劑盒。

本發明的第一方面，提供了一種DNA序列編輯方法，所述方法包括步驟：

提供第一DNA重組片段，所述第一DNA重組片段具有第一篩選標記，和供酶切割的切割位點，通過同源重組將所述第一DNA重組片段整合入所述DNA序列待編輯位點的一側；

提供第二DNA重組片段，所述第二DNA重組片段具有與所述第一DNA重組片段中的所述切割位點兩側序列同源的同源臂；

酶切割整合入所述DNA序列的所述第一DNA重組片段，在所述切割位點形成切口，通過同源重組將所述第二DNA重組片段整合入待編輯DNA序列中，從而實現所述DNA序列編輯。

在另一優選例中，所述“整合”包括替換目標DNA序列的一段序列或向目標DNA序列中插入一段外源的DNA序列。

在另一優選例中，所述第二DNA重組片段中包括替代序列，通過同源重組將待編輯位點替換為所述替代序列。

在另一優選例中，所述方法包括步驟：

(1)在待編輯DNA序列內設定第一識別位點

所述第一識別位點位于待編輯位點附近的一側或該位點上；

(2)提供第一DNA重組片段