[發(fā)明專利]一種DNA序列編輯的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201611022023.8 | 申請日： | 2016-11-21 |
| 公開（公告）號： | CN108085328B | 公開（公告）日： | 2021-06-22 |
| 發(fā)明（設計）人： | 王金;趙國屏;張宏 | 申請（專利權）人： | 中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心 |
| 主分類號： | C12N15/66 | 分類號： | C12N15/66;C12N15/65 |
| 代理公司： | 上海一平知識產(chǎn)權代理有限公司 31266 | 代理人： | 陳詳;陸鳳 |
| 地址： | 200032 上*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 dna 序列 編輯 方法 | ||
1.一種DNA序列編輯方法，其特征在于，所述方法包括步驟：
提供第一DNA重組片段，所述第一DNA重組片段具有第一篩選標記，和供酶切割的切割位點，通過同源重組將所述第一DNA重組片段整合入所述DNA序列待編輯位點的一側；
提供第二DNA重組片段，所述第二DNA重組片段具有與所述第一DNA重組片段中的所述切割位點兩側序列同源的同源臂；
酶切割整合入所述DNA序列的所述第一DNA重組片段，在所述切割位點形成切口，通過同源重組將所述第二DNA重組片段整合入待編輯DNA序列中，從而實現(xiàn)所述DNA序列編輯。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的“將所述第一DNA重組片段整合入所述DNA序列待編輯位點的一側”和“將所述第二DNA重組片段整合入待編輯DNA序列中”中的“整合”分別包括替換目標DNA序列的一段序列或向目標DNA序列中插入一段外源的DNA序列。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二DNA重組片段中包括替代序列，通過同源重組將待編輯位點替換為所述替代序列。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：
(1)在待編輯DNA序列內設定第一識別位點
所述第一識別位點位于待編輯位點的一側；
(2)提供第一DNA重組片段
所述第一DNA重組片段具有第一篩選標記，第二識別位點和位于所述第一篩選標記兩側的同源臂，所述同源臂與所述第一識別位點兩側的序列同源；
(3)第一次同源重組
在所述第一識別位點切開待編輯DNA序列，通過同源重組將所述第一DNA重組片段整合入待編輯位點的一側；
(4)提供第二DNA重組片段
所述第二DNA重組片段具有與所述第二識別位點兩側序列同源的同源臂；
(5)第二次同源重組
在所述第二識別位點切開DNA序列，通過同源重組將所述第二DNA重組片段整合入待編輯DNA序列中，從而實現(xiàn)所述DNA序列編輯。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二DNA重組片段中包括替代序列，在步驟(5)中通過第二次同源重組，將所述待編輯位點替換為所述替代序列。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二識別位點位于所述第一篩選標記內。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中通過第二次同源重組去除第一次同源重組中整合入的外源DNA序列。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA序列編輯方法為對基因組特定位點進行編輯的方法。
9.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述同源臂的長度為40bp-1000bp。
10.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一識別位點和所述第二識別位點分別獨立地選自：酶切位點、CRISPR系統(tǒng)切割位點、TALEN切割位點、ZFN切割位點、Argonaute切割位點中的任意一種或幾種。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的酶切位點為歸位核酸內切酶酶切位點。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的歸位核酸內切酶酶切位點為I-SceI酶切位點或I-CeuI酶切位點。
13.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一識別位點和所述第二識別位點分別為不同的CRISPR系統(tǒng)所對應的切割位點。
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