[發明專利]一種磷酸化肽富集材料及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201611019827.2
• 申請日: 2016-11-18
• 公開（公告）號: CN106749884B
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 孫濤壘;梁鑫淼;卿光焱;李秀玲;陸琦;姜舸
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學;中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C08F220/54
• 分類號: C08F220/54;C08F220/60;C07K1/22
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

本發明涉及材料分析化學和有機化學領域。本發明提供一種磷酸化肽富集材料及其制備方法與應用。該磷酸化肽富集材料包括基底及形成于基底表面的雙組分共聚物層，雙組分共聚物層的厚度為10?80nm。本發明是利用表面引發?原子轉移自由基聚合反應機制，將雙組分共聚物接枝到基底表面。本發明將該材料與柱固相萃取模式或分散固相萃取模式有機的結合可實現復雜混合物中磷酸化肽高選擇性、高重復性和高通量地富集，從而實現多磷酸化肽和單磷酸化肽的選擇性富集，可顯著提高磷酸化蛋白鑒定數目。因此，其有望在磷酸化肽富集，進而大規模分離磷酸化蛋白等方面獲得廣泛的應用。

技術領域

本發明涉及材料分析化學和有機化學領域，尤其涉及一種磷酸化肽富集材料及其制備方法與應用。

背景技術

蛋白質的磷酸化是生物體內最常見、最重要的蛋白翻譯后修飾方式之一，因此磷酸化蛋白質組學研究引起了眾多世界科學家的廣泛關注。但是由于磷酸化蛋白質在生物體內絕對含量很低，目前，進行磷酸化蛋白質組學研究的技術策略主要是在蛋白質或肽段水平上富集之后進行。已有的磷酸肽富集方法主要有：固定金屬離子親和色譜法，金屬氧化物法，離子交換色譜法，以及上述幾種技術的聯用。但是這些方法存在多磷酸化肽難以洗脫、非特異性吸附酸性肽鏈或者帶堿性殘基磷酸化肽難以保留的問題，因此無法實現復雜生物樣品大規模富集磷酸化肽的目的。

發明內容

本發明為了解決上述技術問題提供一種對磷酸化肽具有顯著識別能力的磷酸化肽富集材料及其制備方法與應用。該材料提供了一種具有高選擇性、高吸附量、操作簡單和重復性好的磷酸化肽的分離富集方法，能對生物樣品中相對低含量的單磷酸化肽和多磷酸化肽進行選擇性富集和分離。

本發明采用如下技術方案來實現：

一種雙組分共聚物，所述雙組份共聚物具有如下所示的分子結構：

其中R為羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氫；X＝0.01-0.5。

上述方案中，包括基底及形成于基底表面的雙組分共聚物層，所述雙組分共聚物的分子結構如權利要求1所述，所述雙組分共聚物層的厚度為10-80nm。

上述方案中，所述基底的材料為Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一種或者兩種以上任意比例的混合。

所述的磷酸化肽富集材料的制備方法，該制備方法是利用表面引發-原子轉移自由基聚合反應機制，將雙組分共聚物接枝到基底表面，具體制備方法如下：

1)在反應容器中依次加入異丙基丙烯酰胺和硫脲功能單體，同時加入超純水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶劑，其中，異丙基丙烯酰胺和硫脲功能單體的摩爾比1-20:1，超純水與二甲基甲酰胺的體積比為1:1-10；

2)在無氧條件下加入催化劑和配體，將基底浸入前述溶液中，保持氮氣氣氛，在恒溫60-80℃條件下進行原子轉移自由基聚合反應4-24小時；

3)反應結束后，洗滌基底表面并在30-80℃下真空干燥，得到所述磷酸化肽富集材料。

所述的磷酸化肽富集材料在磷酸化肽富集分離中的應用方法，采用柱固相萃取模式，具體步驟如下：

1)將磷酸化肽富集材料裝入移液槍槍頭或者凝膠上樣吸頭中，形成微固相萃取柱，采用活化液和平衡液活化及平衡微固相萃取柱，將蛋白酶解物溶解于平衡液中，并上到微固相萃取柱上，磷酸化肽富集材料與蛋白酶解物的質量比為100:1-1000:1；

2)采用5-200倍柱體積pH 0-7的有機溶液沖洗萃取柱；