[發明專利]一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 201611019626.2
• 申請日: 2016-11-21
• 公開（公告）號: CN106754768B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 呂鳳霞;錢輝;陸兆新;張充;別小妹;趙海珍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 孫昱

本發明提供了一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法，其中脂肪氧合酶突變體具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一種所示的氨基酸序列；構建方法為首先確定魚腥藻脂肪氧合酶突變位點，然后以重組質粒為模板，在突變位點處利用NNK代替原有密碼子設計簡并引物，進行全質粒PCR反應，構建3個定點飽和突變庫，然后通過轉化大腸桿菌和抗性篩選得到3個飽和突變庫；最后對3個飽和突變庫進行抗性篩選和誘導突變，通過進一步純化得到純的脂肪氧合酶突變體。本發明的脂肪氧合酶突變體的熱穩定性獲得了提高，具有較高的實際應用價值和廣闊的市場前景。

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法。

背景技術

LOX（Lipoxygenase，LOX）是非血紅素、非硫鐵過氧化酶，它能催化具有順,順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸及其酯類發生空間及位置特異性的雙加氧反應，生成相應的氫過氧化物。在植物中其天然底物主要是亞油酸和亞麻酸，在動物體內其天然底物主要是花生四烯酸。LOX作為無毒、無害、天然的添加劑在食品、醫藥、化工等領域有著重要的應用價值。在面粉的加工過程中它能夠將面粉中的多不飽和脂肪酸催化氧化成氫過氧化物，這些氫過氧化物能夠起到提高面粉白度，增強面筋蛋白強度的作用。另外，在污水處理與環境保護方面，可以用于染料的降解。然而脂肪氧合酶熱穩定性差的缺陷限制了其在工業上的應用。因此，通過分子改造來提高脂肪氧合酶熱穩定性以期獲得酶學性質更適用工業應用的突變酶是目前的研究熱點。

發明內容

本發明目的是為了提供一種酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法，提高了脂肪氧合酶突變體的熱穩定性，擴展了應用范圍。

本發明的技術方案如下：

一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體，該脂肪氧合酶突變體具有如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一種所示的氨基酸序列。

一種以上所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體中PCR反應的簡并引物，其特征在于，該簡并引物具體如下：

N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；

N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；

S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；

S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；

G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；

G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。

一種以上所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，包括以下步驟：

（1）魚腥藻脂肪氧合酶突變位點確定：將魚腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸作為飽和突變位點；

（2）魚腥藻脂肪氧合酶突變體庫的建立及突變體篩選：以重組質粒為模板，在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸相對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子設計簡并引物，該簡并引物如以上所述，進行全質粒PCR反應，構建3個定點飽和突變庫，DpnI消化模板，純化后產物直接轉化大腸桿菌，將轉化后的大腸桿菌涂布于含有100 μg/ml氨芐抗性LB平板上，37℃下培養16-24小時，得到3個飽和突變庫；