[發明專利]一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 201611019626.2
• 申請日: 2016-11-21
• 公開（公告）號: CN106754768B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 呂鳳霞;錢輝;陸兆新;張充;別小妹;趙海珍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 孫昱

1.一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體，其特征在于，脂肪氧合酶突變體具有如SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一種所示的氨基酸序列。

2.一種構建權利要求1所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體中PCR反應的簡并引物，其特征在于，該簡并引物具體如下：

N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；

N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；

S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；

S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；

G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；

G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。

3.一種權利要求1所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）魚腥藻脂肪氧合酶突變位點確定：將魚腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸作為飽和突變位點；

（2）魚腥藻脂肪氧合酶突變體庫的建立及突變體篩選：以重組質粒為模板，在魚腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸相對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子設計簡并引物，該簡并引物如權利要求2所述，進行全質粒PCR反應，構建3個定點飽和突變庫，DpnI消化模板，純化后產物直接轉化大腸桿菌，將轉化后的大腸桿菌涂布于含有氨芐抗性LB平板上，37℃下培養16-24小時，得到3個飽和突變庫；

（3）取3個飽和突變庫的菌落接種于含有氨芐LB培養基的96孔板中，于37℃過夜培養，得到3個突變體庫的母版，取母版接種于含有氨芐LB培養基的96孔板中，37℃下培養3h，再加入IPTG低溫誘導16h；然后裂解菌體，得到粗酶液，將粗酶液在50℃條件下孵育5min，冷卻，測定殘余活力，得到陽性突變體；

（4）將步驟（3）得到的陽性突變體接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃，180rpm 培養至OD600為0.6-0.8 時，加IPTG低溫誘導，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，將上清液過Ni-NTA親和柱純化，透析去除咪唑即得到純的脂肪氧合酶突變體；純酶液測定50℃下的半衰期，確定每個突變體庫中熱穩定性最高的突變體，得到三個熱穩定性與酶活提高的突變體，分別為N130D，G260A和S437T；以N130D的基因作為模板，進行突變體組合：針對260位甘氨酸、437位絲氨酸位點設計飽和突變庫，并進行新一輪的篩選；經過組合突變，獲得了兩株熱穩定性與酶活力顯著提高的突變株，分別為：N130D/G260Q，N130D/S437Y。

4.根據權利要求3所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，其特征在于，步驟（2）中大腸桿菌為大腸桿菌E. coli BL21(DE3)。

5.根據權利要求3所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，其特征在于，步驟（2）中重組質粒為重組質粒pET32a-Ana-LOX。

6.根據權利要求3所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，其特征在于，步驟（2）中全質粒PCR反應的反應條件為：96℃ 5 min；然后98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 90s，共25個循環；最后72℃ 5 min。

7.根據權利要求3所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，其特征在于，步驟（3）中裂解菌體采用凍融破碎的方法進行，具體為-70℃冷凍2小時，室溫融化1小時，反復凍融。

8.權利要求1所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體在食品、制藥、造紙或污水處理中的應用。