[發(fā)明專利]一種快速定量檢測(cè)芽孢桿菌發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)體和芽孢體的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611010404.4
• 申請(qǐng)日: 2016-11-17
• 公開（公告）號(hào): CN106525799B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭小華;楊菁菁;字春麗;陳沙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南民族大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 武漢華旭知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 42214
• 代理人: 劉天鈺

本發(fā)明提供了一種從芽孢桿菌發(fā)酵液中快速定量檢測(cè)芽孢體和營(yíng)養(yǎng)體的方法。包括芽孢萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞NADH的提取及其熒光檢測(cè)。將營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞離心得菌體，經(jīng)提取NADH并測(cè)定熒光強(qiáng)度；然后將芽孢細(xì)胞經(jīng)過萌發(fā)劑萌發(fā)，在細(xì)胞不顯著增殖的前提下在細(xì)菌培養(yǎng)液混合1.5h得到由芽孢轉(zhuǎn)化成的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞NADH含量，最后通過增加的NADH含量計(jì)算出芽孢的濃度。本發(fā)明可適用于基于芽孢桿菌純培養(yǎng)的發(fā)酵體系，尤其是以芽孢桿菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)微生態(tài)制劑，能實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程監(jiān)控或者終端產(chǎn)品的快速、靈敏測(cè)定。亦可用于食品、環(huán)境中的芽孢數(shù)量的定量檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及一種快速定量檢測(cè)芽孢桿菌發(fā)酵液中芽孢體和營(yíng)養(yǎng)體的方法，特別是基于芽孢體和營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞中NADH的差別實(shí)現(xiàn)兩種不同形態(tài)細(xì)胞的快速定量測(cè)定，屬于微生物發(fā)酵和檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧并能夠產(chǎn)生具有抗逆性的內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌，因?yàn)檠挎邨U菌的芽孢特性使其能夠?qū)?、紫外線、輻射等不利條件有很強(qiáng)抗性。芽孢桿菌中具有很多特殊功能的菌株，在實(shí)際應(yīng)用中具有較大價(jià)值。有的菌株能分泌多種酶類，是酶制劑的良好來源；大部分菌株與動(dòng)植物關(guān)系密切互惠共生，可以用于益生菌制劑和菌肥；有的還可以用于生產(chǎn)微生物農(nóng)藥；芽孢桿菌還能在農(nóng)藥降解、污染凈化等環(huán)保領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

在應(yīng)用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，都需要監(jiān)控芽孢桿菌的生長(zhǎng)代謝和菌體細(xì)胞累積情況，而基于芽孢桿菌特殊的生理特征，在生長(zhǎng)后期、營(yíng)養(yǎng)缺乏或者產(chǎn)物抑制等情況下芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)伴隨有大量芽孢體產(chǎn)生，某些發(fā)酵調(diào)控需要盡可能減少芽孢的生產(chǎn)，如酶制劑的擴(kuò)大生產(chǎn)；而有些則需要?jiǎng)?chuàng)造條件促進(jìn)芽孢積累，如芽孢類益生菌的制備。無(wú)論哪種情況均需要對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體分別進(jìn)行定量測(cè)定，通常其測(cè)定方法也均是參照普通細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方式，即傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，人為誤差較大，干擾因素比較多。對(duì)于芽孢桿菌而言，傳統(tǒng)方法無(wú)法特異性將芽孢體和營(yíng)養(yǎng)體區(qū)分開，實(shí)際操作時(shí)一般根據(jù)芽孢的耐熱性通過加熱處死營(yíng)養(yǎng)體后再進(jìn)行平板計(jì)數(shù)來定量測(cè)定芽孢，加熱的過程本身亦會(huì)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)體向芽孢體的轉(zhuǎn)變，因此，對(duì)芽孢桿菌的定量測(cè)定而言，常規(guī)的測(cè)定操作更繁瑣，誤差更大，不適合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。

目前已有其他替代技術(shù)應(yīng)用各種微生物快速檢測(cè)，如PCR技術(shù)、ELISA法、基因芯片技術(shù)、生物傳感法、免疫熒光技術(shù)以及基于菌體特定的熒光分子的生物熒光法(ATP、NADH)等。這些手段大大提高了檢測(cè)速度，并具有一定的靈敏性，但這些方法缺乏通用性，需要昂貴的儀器及其配套試劑，或者操作過程相對(duì)復(fù)雜，推廣應(yīng)用難度較大。尤其對(duì)于芽孢桿菌而言，缺乏特異性的區(qū)分其營(yíng)養(yǎng)體和芽孢體的檢測(cè)方法和技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種從芽孢桿菌發(fā)酵液中快速定量檢測(cè)芽孢體和營(yíng)養(yǎng)體的方法，該方法能有效區(qū)分芽孢和營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，而且方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，重現(xiàn)性好。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種快速定量檢測(cè)芽孢桿菌發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)體和芽孢體的方法，包括以下步驟：(1)將待測(cè)的芽孢桿菌發(fā)酵液離心、洗滌并重懸到緩沖液中，充分混勻后得到菌懸液；

(2)量取菌懸液，對(duì)菌懸液中的NADH進(jìn)行提取，提取液采用濃度為1.5～2mol/L的KOH乙醇溶液，將提取液與菌懸液按照不小于3：1的體積比充分混合均勻，加熱至80～90℃，在此溫度下處理30～60分鐘，處理完畢后離心取上清液，檢測(cè)上清液中NADH的熒光強(qiáng)度，記錄檢測(cè)結(jié)果；

(3)再次量取步驟(1)中的菌懸液，將其放在含有外在萌發(fā)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌懸液中的芽孢體充分萌發(fā)變成營(yíng)養(yǎng)體，然后采用與步驟(2)中相同的方法對(duì)培養(yǎng)后的菌懸液中的NADH進(jìn)行提取，并檢測(cè)上清液中NADH的熒光強(qiáng)度，記錄檢測(cè)結(jié)果；