[發明專利]一種快速定量檢測芽孢桿菌發酵液中營養體和芽孢體的方法有效
| 申請號： | 201611010404.4 | 申請日： | 2016-11-17 |
| 公開（公告）號： | CN106525799B | 公開（公告）日： | 2019-03-01 |
| 發明（設計）人： | 郭小華;楊菁菁;字春麗;陳沙 | 申請（專利權）人： | 中南民族大學 |
| 主分類號： | G01N21/64 | 分類號： | G01N21/64 |
| 代理公司： | 武漢華旭知識產權事務所 42214 | 代理人： | 劉天鈺 |
| 地址： | 430074 湖北*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 芽孢 芽孢桿菌 體細胞 快速定量 發酵液 營養體 檢測 發酵劑生產 微生態制劑 細菌培養液 細胞 定量檢測 發酵過程 發酵體系 含量計算 芽孢萌發 芽孢細胞 熒光檢測 終端產品 純培養 增殖的 熒光 菌體 靈敏 監控 轉化 | ||
1.一種快速定量檢測芽孢桿菌發酵液中營養體和芽孢體的方法，其特征在于包括以下步驟：(1)將待測的芽孢桿菌發酵液離心、洗滌并重懸到緩沖液中，充分混勻后得到菌懸液；
(2)量取菌懸液，對菌懸液中的NADH進行提取，提取液采用濃度為1.5～2mol/L的KOH乙醇溶液，將提取液與菌懸液按照不小于3：1的體積比充分混合均勻，加熱至80～90℃，在此溫度下處理30～60分鐘，處理完畢后離心取上清液，檢測上清液中NADH的熒光強度，記錄檢測結果；
(3)再次量取步驟(1)中的菌懸液，將其放在含有外在萌發劑的培養基中進行培養，培養至菌懸液中的芽孢體充分萌發變成營養體，然后采用與步驟(2)中相同的方法對培養后的菌懸液中的NADH進行提取，并檢測上清液中NADH的熒光強度，記錄檢測結果；
(4)取已知初始活菌濃度的營養體懸液，分別進行稀釋，然后采用與步驟(2)中相同的NADH提取及熒光強度檢測方法，作出活菌濃度與NADH熒光強度的關系曲線，并以此曲線作為標準曲線分別計算出步驟(2)和步驟(3)中熒光強度檢測結果所對應的活菌濃度值，其中步驟(2)所對應的活菌濃度值即為營養體濃度值，將步驟(3)所對應的活菌濃度值減去步驟(2)所對應的活菌濃度值即為芽孢體濃度值。
2.根據權利要求1所述的快速定量檢測芽孢桿菌發酵液中營養體和芽孢體的方法，其特征在于：所述的熒光強度檢測中的檢測參數為：掃描速度3000nm/min；EX狹縫10.0nm；EM狹縫20.0nm；光電倍增管電壓400V；響應0.08s；激發波長為344nm，發射波長為456nm。
3.根據權利要求1所述的快速定量檢測芽孢桿菌發酵液中營養體和芽孢體的方法，其特征在于：步驟(3)中所述外在萌發劑為含有L-Ala，L-Gln和L-Val營養性萌發劑的液體培養基。
4.根據權利要求1所述的快速定量檢測芽孢桿菌發酵液中營養體和芽孢體的方法，其特征在于：步驟(4)中標準曲線的具體繪制方法為：取OD600nm為0.8的營養體懸液，采用平板稀釋法進行平板活細胞計數，確定其初始的活菌濃度，以確定活菌濃度的營養體懸液為基礎，分別進行2倍、10倍、20倍、100倍、200倍、1000倍梯度稀釋，對稀釋的菌懸液進行NADH提取和熒光檢測，空白為Tris-HCl緩沖液，從而根據檢測結果作出活菌濃度與NADH熒光強度的關系曲線。
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