[發明專利]一種蛋白質甲基化的分析處理方法及其應用

在審

• 申請號: 201611006806.7
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN108072555A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 葉明亮;王科云
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N30/96
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種蛋白質甲基化的分析處理方法，利用甲基化修飾的賴氨酸和精氨酸會抑制胰蛋白酶的酶切這一特性，發展了一種綜合了重標甲硫氨酸細胞培養氨基酸穩定同位素標記(heavy methyl stable isotope labeling by amino acids in cell culture，hM?SILAC)，多酶酶切和強陽離子交換微柱(SCXtip)分離的樣品處理方法，并將其應用于甲基化蛋白質組的規模化分析中。通過結合多酶酶切策略，有效的降低了非甲基化來源的漏切位點，并通過高pH范圍的強陽離子交換色譜的分離策略，有效的克服了含有組氨酸的肽段的干擾。從而極大的提高了甲基化肽段的分離特異性。

技術領域

本發明屬于蛋白質組學研究方向甲基化蛋白質組學技術領域，具體涉及蛋白質甲基化的分析處理方法及其應用。

背景技術

蛋白質的甲基化修飾是由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)依賴的甲基轉移酶催化產生的，是最常見的蛋白質翻譯后修飾之一。甲基化修飾在很多的生理過程的調控中發揮著重要的調控作用。研究表明：蛋白甲基化可以調節目標蛋白分子內或分子間的相互作用；影響它們和RNA的親和作用，從而影響著多種細胞進程，包括轉錄調節、細胞定位、核糖體裝配、RNA加工、不均一核糖核酸核糖體蛋白(hnRNPs)的成熟、蛋白-蛋白相互作用、翻譯的準確性、細胞核運輸、蛋白核酸運輸和代謝以及細胞內信號傳導等。由于甲基化的多樣性及復雜性，在蛋白質組學水平上鑒定甲基化位點仍然十分的困難，這主要是因為蛋白質中甲基的引入除了增加甲基化氨基酸殘基的空間位阻和減少氨基酸殘基的氫鍵作用力外，并沒有顯著改變氨基酸殘基的凈電荷或者等電點，這使得甲基化蛋白質/肽段的高效分離富集比較困難，極大的影響了分析的靈敏度。

發生甲基化修飾后的賴氨酸殘基和精氨酸殘基的碳端(C端)不容易被胰蛋白酶(trypsin)識別而導致漏切。因為甲基化修飾不會改變賴氨酸殘基和精氨酸殘基的帶電性質，這些漏切肽段會比普通的酶切肽段多帶一些正電荷，因而可以利用低pH范圍的離線(off-line)SCX分離策略對這些甲基化肽段進行分離(文獻1.Uhlmann,T.；Geoghegan,V.L.；Thomas,B.；Ridlova,G.；Trudgian,D.C.；Acuto,O.Mol Cell Proteomics 2012,11,1489-1499)。但是在低pH范圍的SCX色譜分離條件下，非甲基化的漏切肽段和含有組氨酸的肽段也會多帶一些正電荷，因而會對甲基化肽段的高效分離造成干擾。據報道，在甲基化肽段比較集中的SCX餾分中，含有組氨酸的肽段會占到了全部肽段的60-70％，極大的影響了分離的特異性。

本發明首次利用高pH范圍的強陽離子交換色譜(strong cation exchangechromatography，SCX)分離的思路，借助于重標甲硫氨酸細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術(heavy methyl stable isotope labelling by amino acids in cell culture，hM-SILAC)和多酶酶切技術，顯著提高了鑒定的可信度，并降低了分離過程中非甲基化肽段的干擾，從而實現了甲基化蛋白質組學樣品的高通量分析。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高通量的集SCXtip分離技術，重標甲硫氨酸細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術和多酶酶切技術于一體的甲基化蛋白質組樣品處理方法。

本發明提出的甲基化蛋白質組樣品的綜合分析方法，利用了甲基化修飾后的賴氨酸和精氨酸不容易被胰蛋白酶酶切而導致漏切這一特性，實現了基于SCXtip的甲基化蛋白質組學的分離和分析。

本發明采用的技術方案為：

一種蛋白質甲基化的分析處理方法：

(1)利用重標甲硫氨酸細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術將蛋白質中的賴氨酸和精氨酸上的甲基化修飾基團進行重標標記；